专利名称：提取楠木rna的方法
技术领域：
本发明涉及提取楠木RNA的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
楠木为樟科常绿大乔木，分布区位于亚热带常绿阔叶林区西部，气候温暖湿润，年平均温17°C左右，I月平均温7°C左右，年降水量140(Γ1600毫米。国家二级保护渐危种。楠木为我国特有，是驰名中外的珍贵用材树种。四川有天然分布，是组成常绿阔叶林的主要树种。由于历代砍伐利用，致使这一丰富的森林资源近于枯竭。现存林分，多系人工栽培的半自然林和风景保护林，在庙宇、村舍、公园、庭院等处尚有少量的大树，但病虫危害较严重,也相继在衰亡。为了更好地保护濒临灭绝的楠木，需要对楠木的生长环境、栽培育苗、生理指标、 资源分布等进行调查和研究，特别是采用现代分子生物学的手段对楠木RNA进行测序，更有利于楠木的育种研究。楠木RNA主要从楠木叶片中提取得到，楠木叶片富含芳香油(精油)、多糖、多酚类次级代谢产物成分，是楠木总RNA提取和纯化试验中最重要的干扰物质，也为后续的RNA结构和功能、cDNA文库构建、楠木种子萌发以及材质发育相关基因的转录水平研究增加了困难。并且，楠木中RNA含量相对较低，这也是提取纯化试验中的难题。目前，对于RNA的提取方法主要有传统的Trizol以及改良试剂方法，CTAB,Tris-SDS、异硫氰酸胍和皂土试剂等方法，另外，还有一些商业试剂盒等。但是上述方法用于提取楠木RNA时，却存在一些缺陷。传统的Trizol以及改良试剂方法不能获得楠木叶片RNA ;而CTAB、Tris-SDS、异硫氰酸胍和皂土试剂等方法提取的楠木叶片总RNA含量和纯度都很低，不能满足文库构建等研究的需求；使用国内以及国际的商业化试剂盒获得的楠木叶片总RNA纯度高，但较低的RNA含量相对提高了试验费用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本较低的提取楠木RNA的方法。本发明提取楠木RNA的方法包括如下步骤a、按重量份取O. I份楠木叶片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的预处理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2 4wt%，乙二胺四乙酸的浓度为80 UOmmolL-1，β -巯基乙醇的浓度为I. 5 2. 5%ν/ν ；b、匀浆液静置I 3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。
目前的RNA的提取方法一般都是直接进行裂解处理，没有前处理步骤，本发明方法通过乙酸乙酯+预处理液处理，可以除去大部分精油脂类、糖类、酚类和色素类杂质，有利于提高楠木RNA纯度。进一步的，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液的温度优选为40 440C。a步骤中所述的预处理液的温度最优选为42°C。其中，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液优选为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3wt%，乙二胺四乙酸的浓度为lOOmmolL—1，β-巯基乙醇的浓度为2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步骤可以按照常规方法进行。进一步的，为了提高楠木RNA纯度，c步骤中所述的裂解剂优选为Tris-SDS裂解液，其组成为IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%β -巯基乙醇，ρΗ=7. 5。 其中，为了提高楠木RNA纯度，以使更多的糖类析出，上述方法的d步骤中裂解后的溶液除去多糖等杂质的方法优选为加入高盐溶液和酸酚/氯仿溶液，混匀，离心，弃沉淀，所得上清液进入萃取步骤；所述的高盐溶液为I. O I. 4mol/L氯化钠和O. 6 I. Omol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比1:1的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至3. 7 ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为I. 6
2.4:2. 5 3. 5。进一步的，所述的高盐溶液最优选为I. 2mol/L氯化钠和O. 8mol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比I I的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至4. O ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为2:3。本发明方法通过复合高盐(氯化钠和柠檬酸钠的搭配)更利于多糖类的析出。其中，上述e步骤中，优选采用二氯甲烷萃取楠木RNA。本发明方法采用二氯甲烷萃取楠木，其效果优于三氯甲烷，除杂效果更好。其中，本发明方法适用于楠木属的各种楠木RNA的提取,特别适合于桢楠PhoebezhennanS. Lee et FN WeiRNA 的提取。本发明方法通过乙二胺四乙酸盐溶液与乙酸乙酯混合对楠木材料预处理抽提多种次级代谢产物，减少RNA提取过程中的杂质干扰与污染，所提取的楠木RNA的纯度较高，所需试剂便宜，步骤简单，本发明为楠木RNA的提取提供了一种新的方法，具有广阔的应用前景。
图I为不同RNA提取方法的琼脂糖电泳比较结果图。M :Marker(自上依次为2000、1000、750、500、250、100) ;A_B分别为Trizol和其改良试剂法；C :皂土法、D-E :CTAB法及其改良方法；F =Tris-SDS法；G :异硫氰酸胍法；H :试剂盒法；1 :本发明方法。
具体实施例方式本发明提取楠木RNA的方法包括如下步骤a、按重量份取O. I份楠木叶片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的预处理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2 4wt%，乙二胺四乙酸的浓度为80 UOmmolL-1，β -巯基乙醇的浓度为I. 5 2. 5%ν/ν ；b、匀浆液静置I 3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；C、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。目前的RNA的提取方法一般都是直接进行裂解处理，没有前处理步骤，本发明方法通过乙酸乙酯+预处理液处理，可以除去大部分精油脂类、糖类、酚类和色素类杂质，有利于提高楠木RNA纯度。·进一步的，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液的温度优选为40 440C。a步骤中所述的预处理液的温度最优选为42°C。其中，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液优选为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3wt%，乙二胺四乙酸的浓度为lOOmmolL—1，β-巯基乙醇的浓度为2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步骤可以按照常规方法进行。进一步的，为了提高楠木RNA纯度，c步骤中所述的裂解剂优选为Tris-SDS裂解液，其组成为IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%β -巯基乙醇，ρΗ=7. 5。其中，为了提高楠木RNA纯度，以使更多的糖类析出，上述方法的d步骤中裂解后的溶液除去多糖等杂质的方法优选为加入高盐溶液和酸酚/氯仿溶液，混匀，离心，弃沉淀，所得上清液进入萃取步骤；所述的高盐溶液为I. O I. 4mol/L氯化钠和0. 6 I. Omol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比1:1的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至3. 7 ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为I. 6
2.4:2. 5 3. 5。进一步的，所述的高盐溶液最优选为I. 2mol/L氯化钠和0. 8mol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比I: I的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至4. O ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为2:3。本发明方法通过复合高盐(氯化钠和柠檬酸钠的搭配)更利于多糖类的析出。其中，上述e步骤中，优选采用二氯甲烷萃取楠木RNA。本发明方法采用二氯甲烷萃取楠木，其效果优于三氯甲烷，除杂效果更好。其中，本发明方法适用于楠木属的各种楠木RNA的提取,特别适合于桢楠PhoebezhennanS. Lee et FN WeiRNA 的提取。下面结合实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例I采用本发明方法提取楠木RNAI).将乙二胺四乙酸盐预处理溶液(处理液(3%可溶性PVP，2%i3-巯基乙醇，IOOmmoIL-1乙二胺四乙酸)预热至42°C ；2).将0. Ig楠木(桢楠Phoebe zhennan S. Lee et FN Wei,下同)叶片于液氮中研磨粉末后加入到Iml预热的预处理液中，再加入500 μ I乙酸乙酯，漩涡振荡器混匀；3).将匀浆液于室温水平静置1-3分钟；4°C 4000g离心3min ;此时离心管中成分分为三层，上层为乙酸乙酯层，中间层是乙二胺四乙酸盐溶液层，最下层楠木组织为沉淀。弃去上面两层，保留沉淀；4).向离心管中加入 Iml 的 Tris-SDS 裂解液(100mmol/LTris-HCl, 400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%i3 -巯基乙醇，pH=7. 5)，将沉淀摇起混匀，室温水平静置3_5分钟；5).加200μ1 2Μ的高盐溶液(1.2mol/L氯化钠，O. 8mol/L柠檬酸钠)，摇匀，再加入300 μ I酸酚/ 二氯甲烷(体积比1:1，用2mol/L的醋酸钠(NaOAc，pH 3. 7)调pH值至
4.O)，混勻后 4°C 13000g 离心 5min ；6).上清液转入2ml离心管中，加入500μ I 二氯甲烷，摇匀后4°C 13000g离心5min ； 7).上清液转入新的2ml离心管中，加入lml-20°C预冷的异丙醇，摇匀后水平静置5 分钟,4°C 13000g 离心 5min ；8).沉淀用75%乙醇洗涤两次，最后用50 μ I RNase-free水中，_80°C冻存。采用现有的方法提取楠木RNA，具体如下试验例I Trizol法提取楠木叶片总RNA使用Invitrogen 公司的 TRIzol Reagent (Cat no: 15596-026)提取楠木总 RNA。参照试剂的使用说明书，操作步骤如下取楠木叶片lOOmg，在液氮中研磨至粉末状，加入到含O. 5ml不同RNA提取试剂的EP管中，涡旋混匀；室温静置5min ；12000g 4°C离心5min，上清液转入新的无RNase离心管中；加入RNA提取试剂1/5体积量的氯仿，振荡混匀分层后，再室温静置5min ;12000g 4°C离心15min后上清液转移至新的离心管中；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置IOmin ；12000g 4°C离心IOmin ;弃上清，加入75%乙醇Iml洗漆沉淀，12000g 4°C离心3min后弃去乙醇；室温干燥沉淀3min,加入50 μ LRNase-free水溶解沉淀，-80°C保存。试验例2改良Trizol试剂提取楠木叶片总RNA参照TIANGEN公司的RNAplant提取试剂(Code no:DP437-01)使用手册说明进行。取楠木叶片lOOmg，于液氮中快速研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)，加入到含有O. 5ml提取试剂的I. 5mL EP管中，漩涡震荡至彻底混勻；室温放置5min ；4°C 12000g离心5min,上清转入新的无RNase离心管；加入O. ImL5mol/LNaCl,温和混勻后加入O. 3ml氯仿,颠倒混勻；4°C 12000g离心IOmin,上清转入新的无RNase离心管,加等体积的异丙醇,混勻，室温放置IOmin后4°C 12000g离心IOmin ;弃上清，加Iml 75%乙醇，轻轻颠倒洗涤离心管管壁和RNA沉淀；4°C 12000rg离心3min，用枪头吸出无水乙醇；室温干燥约3min后加入50 μ L无RNase水溶解RNA。如有絮状物，可在室温条件下12000g离心Imin,取上清转入干净的无RNase离心管中，-80°C保存。 试验例3皂土法提取楠木叶片总RNA取楠木叶片lOOmg，于液氮中快速研磨成粉末状，加入到含有0. 5ml皂土提取试剂(25mmol/L 柠檬酸钠(pH 7. 0)，10mmol/L 乙二胺四乙酸，100mmol/L NaCl,0. 5%SDS,1% β -巯基乙醇，0. 5%皂土)的I. 5mL EP管中，漩涡震荡至彻底混匀；室温放置5min ;加入等体积的水饱和酹氯仿异戍(I : I)后4°C 12000g离心5min,上清转入新的无RNase离心管；加入1/2体积的5mol/L醋酸钾(pH 4. 8)，冰上放置IOmin后加等体积氯仿，颠倒混匀；4°C 12000g离心lOmin，上清转入新的无RNase离心管，加等体积的异丙醇，混匀，室温放置IOmin后4°C 12000g离心IOmin ;弃上清，加Iml 75%乙醇，轻轻颠倒洗涤离心管管壁和RNA沉淀；4°C 12000rg离心3min，用枪头吸出无水乙醇；室温干燥约3min后加入50 μ L无RNase水溶解RNA，_80°C保存。试验例4CTAB法及其改良方法提取楠木叶片总RNA取楠木叶片lOOmg，在液氮中研磨至粉末状，加入到含O. 5ml CTAB提取试剂的EP管中，涡旋混匀；60°C水浴lOmin，期间震荡一次；冷却至室温后加入等体积的水饱和酚氯仿异戊醇(25 24 1)，摇匀后12000g 4°C离心lOmin，吸取上清液于新离心管中，力口入 1/10 体积 2mol/L Nacl (或 4mol/L KAc (pH 值 4. 8)，改良 CTAB 法)、1/10 体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀，然后加入等体积氯仿异戊醇(24 1)，混匀，12000g 4°C离心lOmin，上清液转入新的无RNase离心管中；加入等体积异丙醇，摇匀后室温静置IOmin ；12000g 4°C离心IOmin后弃上清，加入75%乙醇Iml洗涤沉淀，12000g 4°C离心3min后弃去乙醇；室温干燥沉淀3min,加入50 μ L RNase-free水溶解沉淀，_80°C保存。
试验例5改良Tris-SDS和异硫氰酸胍法将楠木叶片IOOmg于液氮中快速研磨成粉末，迅速置于分别含有600μ L改良Tris-SDS和异硫氰酸胍的RNA提取缓冲液的I. 5mL EP管中，涡旋混匀后室温平放静置511^11，加入20(^1^高盐溶液(I. 2mol/L NaCl，O. 8mol/L柠檬酸钠)摇匀，再加入400yL酸酹/氯仿(I: I)(酸酹pH 4. O),于4 12000g离心IOmin ;上清转入新的无RNase离心管后震荡混匀，再加入400 μ L氯仿(1:1)，振荡至彻底混匀，41 12000g离心IOmin ;上清转入新的无RNase离心管并加入等体积异丙醇,温和混勻后室温放置IOmin,于4°C 12000g离心IOmin,小心倒掉上清；加入ImL 75%乙醇洗涤，于4°C 12000g离心3min,吸出无水乙醇，室温干燥3min，加入50 μ LRNase-free水溶解沉淀。得到RNA溶液并于一 80°C保存。试验例6植物总RNA提取试剂盒法使用TIANGEN 公司的 RNAprep pure Plant Kit (RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒)。参照说明书步骤，取楠木叶片IOOmg,在液氮中研磨至粉末状,加入到含O. 5ml HLRNA提取缓冲液(含1%巯基乙醇)的EP管中，涡旋混匀；将溶液转移至过滤柱CS (过滤柱CS放在收集管中)，12000g 4°C离心5min，上清液转入新的无RNase离心管中；加入O. 5倍上清体积的无水乙醇，混匀后一起加入到吸附柱CR3中，12000g 4°C离心lmin，弃滤液；向吸附柱CR3中加350 μ I去蛋白液RW1，12000g 4°C离心lmin，弃滤液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱0 3中加入50(^1漂洗液1^，室温静置21^11，1200(^ 4°C离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复漂洗一次；12000g4°C离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温3min后放入一个新的RNase-free的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加 50μ1 RNase-free dd H2O,室温 2min 后 12000g 4°C 离心 2min，得到总 RNA 提取液，_80°C保存。楠木叶片总RNA提取效果验证分别取5 μ L提取的总RNA溶液，在1%非变性琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，然后在凝胶成像系统下观察并拍照。取2 μ L样品，用RNase-free水稀释至400 μ L，紫外分光光度计测量其在230、260、280nm处的紫外吸光值㈧。计算A26(lmi/A28(lnm、A260nmA230nm值，确定其纯度，并计算其得率。RNA的得率[yg(100mg)-1] = (A260nmX稀释倍数X40X原液体积)/材料鲜重(IOOmg)。
试验结果如表I和图I所示。表I不同RNA提取方法的得率与纯度比较
权利要求
1.提取楠木RNA的方法，其特征在于包括如下步骤 a、按重量份取O.I份楠木叶片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的预处理液中，再加Λ O. I O. 3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2 4wt%,乙二胺四乙酸的浓度为80 UOmmolL—1，β -巯基乙醇的浓度为I. 5 2. 5%ν/ν ； b、匀浆液静置I 3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀； c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解； d、裂解后的溶液除去多糖等杂质； e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。
2.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于a步骤中所述的预处理液的温度为40 44 °C。
3.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于a步骤中所述的预处理液的温度为42 °C。
4.根据权利要求I 3任一项所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于a步骤中所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3wt%，乙二胺四乙酸的浓度为lOOmmolL—1，β -巯基乙醇的浓度为2%ν/V。
5.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于c步骤中所述的裂解剂为Tris-SDS 裂解液，其组成为100mmol/L Tris-HCl，400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%@ -巯基乙醇，pH=7. 5。
6.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于d步骤中裂解后的溶液除去多糖等杂质的方法为加入高盐溶液和酸酚/氯仿溶液，混匀，离心，弃沉淀，所得上清液进入萃取步骤；所述的高盐溶液为I. O I. 4mol/L氯化钠和O. 6 I. OmoI/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比I: I的混合溶液，并用醋酸钠调节pH值至3. 7 ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为I. 6 2. 4:2. 5 3. 5。
7.根据权利要求6所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于所述的高盐溶液为I.2mol/L氯化钠和0. 8mol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比1:1的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至4.0 ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为2:3。
8.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于e步骤中，采用氯仿萃取楠木RNA。
9.根据权利要求I所述的提取楠木RNA的方法，其特征在于所述的楠木为桢楠Phoebezhennan S. Lee et FN Wei0
全文摘要
本发明涉及提取楠木RNA的方法，属于生物技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种成本较低的提取楠木RNA的方法。本发明提取楠木RNA的方法包括如下步骤按重量份取0.1份楠木叶片，磨成粉，然后加入到0.8～1.5份的预处理液中，再加入0.1～0.3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；b、匀浆液静置1～3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70～80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。
文档编号C12N15/10GK102899318SQ20121042639
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者庄国庆, 龙汉利, 李晓清 申请人:四川省林业科学研究院