源于大鼠及其它动物的多潜能细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及维持多潜能细胞的自我更新能力。本发明提供的方法和组合物适于培 养及分离多潜能细胞如胚胎干细胞（ES)，尤其是哺乳动物的胚胎干细胞，哺乳动物的包括 大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪以及人。本发明尤其涉及大鼠、小鼠和人的多潜能细胞的自我更新 培养以及与之相关的方法及组合物。
【背景技术】
[0002] 目前已广为人知的是：在体外起始及维持多潜能干细胞均是在含有血清和白血病 抑制因子（LIF)的培养基中进行的（Smithetal. (1988)Nature336:688-90)。这类方法 已被用来维持源于"许可的"（permissive)小鼠的多潜能胚胎干细胞（ES)传代（passage) 很多次。维持多潜能干细胞的自我更新还可以通过其它方式来完成，如将干细胞培养在含 有饲养细胞或其提取物的培养基中，通常用小鼠成纤维细胞作为饲养细胞。这些条件使得 在培养基中多次传代人类胚胎干细胞的同时维持其多潜能性状成为可能。
[0003] 许多情况下，ES细胞仅能在含有以下成分的培养基中被维持或最好地维持，如含 有血清或血清提取物的培养基（因此这些培养基的成分是不明确的）；或者含有其它细胞 的培养基，如利用成纤维细胞作为饲养细胞的培养基。但是，任何不明确的成分，不管是本 已存在于培养基中的还是例如由饲养细胞产生的，均可能干扰或阻碍对ES细胞繁殖和分 化的研究。这阻碍了ES细胞及其子细胞在治疗学或其它应用方面的生产实践发展。目前 已有一些成分明确的ES细胞培养基，然而仍需要可供选择的、最好是改良的成分明确的ES 细胞培养基。
[0004] 在本发明的申请人之前的公开号为W0 03/095628的国际申请，及之后还未公开 的一申请中，以下的无血清培养基被用来培养多潜能干细胞如ES细胞并促使其进行多代 自我更新，所用的无血清培养基中含有（l)gpl30激活剂（如LIF)和（2)TGF-0家族或Id 信号传导途径的激活剂（如BMP4)。意外地发现，在gpl30信号传导途径畅通的情况下， TGF-0家族或Id信号传导途径的激活剂可刺激多潜能干细胞自我更新而非向其传递分化 前信号。然而，还需要提高维持多潜能细胞自我复制性状的效率，以及改良一些培养基，这 些培养基用于将多潜能细胞从饲养细胞或含有饲养成分的培养基中转移。
[0005]SatoN等（Nat.Med. 2004,Jan10(l)pp55-63)描述了糖原合成酶激酶3(GSK3)抑 制剂、6-溴靛玉红-3-月亏（6-bromoindirubin-3'_oxime)对培养在含血清培养基中的小鼠 和人ES细胞的影响。然而，仅在很短的时间段内观察了这些影响，这些观察是如此短暂以 致不能得出稳定的结论，并且研究中所用的成分不明确培养基中的未知因子的影响也可能 较显著。本发明的发明人曾经尝试过那个实验，但是不能重复获取所述实验结果，实际上观 察到了与所述结果相反的影响。
[0006] 在配制ES细胞培养基时，人们希望能得到尽可能纯的单独培养基成分。然而，大 部分培养基成分是细胞因子，由于需要在细胞中生产它们继而去除所得产物中潜在的污染 物，这些细胞因子的纯度难以保证。一些细胞因子的另一个问题是：它们仅在很窄的浓度范 围内是有效且无毒的。有较宽浓度范围和/或在较高浓度下具有较小毒性的培养基成分会 很有用。细胞因子的储存稳定性有限，人们也在寻找更稳定的培养基成分。
[0007] 本发明的一个目的是克服或至少改善现有技术中存在的问题，希望提供可供选择 的最好是改善的培养多潜能干细胞的方法和培养基，这些培养基和培养方法能够支持所述 干细胞进行多代自我更新。本发明的另一个目的是提供一种可供选择的培养体系以能够在 体外培养多潜能干细胞并维持其性状直至以可控方式诱导这些干细胞的分化。本发明的一 个更进一步的目的是为改善多潜能干细胞的获得和分离提供方法和组合物，方便从难处理 器官及尚未分离出多潜能干细胞的器官中获取并分离出多潜能干细胞。本发明一个更进一 步的目的是从这些器官中得到多潜能干细胞。
【发明内容】
[0008] 根据本发明的一方面，通过抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和一FGF受体可以促进 多潜能细胞的自我更新。
[0009] 根据本发明，多潜能干细胞如ES细胞，被培养在含有一种MEK抑制因子、一种GSK3 抑制因子和一种FGF受体拮抗剂（例如一种小分子GSK3抑制因子、一种小分子MEK抑制因 子和一种小分子FGFR拮抗剂）的培养基中，优选使用无血清培养基，从而促进干细胞进行 多代的自我更新。因此，抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和FGF受体传导途径刺激了这些细 胞的自我更新。
[0010] 本发明有几方面的应用。可分别通过以下几种组合的抑制来培养多潜能细胞尤其 ES细胞，并使它们适应在无饲养细胞或饲养细胞层（常被称为饲养者或饲养细胞）的培养 基中生长，所述细胞最初起源或被接种于饲养细胞，所述组合是：GSK3和MEK、MEK和FGFR 或GSK3、或MEK和FGFR。在培养基中扩增干细胞的一种方法包括在以下培养基中培养干细 胞，所述培养基含有一种GSK3抑制因子和一种MEK抑制因子，一种MEK抑制因子和一种FGF 受体拮抗剂，或优选同时含有一种GSK3抑制因子、一种MEK抑制因子和一种FGF受体拮抗 齐U。所用的培养基可以含有一或多种GSK3抑制因子和MEK抑制因子，一或多种MEK抑制 因子和FGFR拮抗剂，或者一或多种MEK抑制因子、GSK3抑制因子和FGFR拮抗剂。可利用 GSK3抑制因子和MEK抑制因子，MEK抑制因子和FGFR拮抗剂，或GSK3抑制因子、MEK抑制 因子和FGFR拮抗剂制备ES细胞，包括那些源于某些器官的ES细胞，迄今为止尚未从这些 器官中分离得到过ES细胞。
[0011] 本发明涉及的多潜能细胞包括但不限于ES细胞。多潜能细胞（包括ES细胞）的 特性包括表达多种与多潜能发育阶段相关的基因，能分化为同一主体动物中的任意及所有 组织的典型细胞的能力，助于形成嵌合体的能力，尤其助于形成嵌合种系的能力。真正的多 潜能细胞，例如ES细胞，即使不表达所有，也应该可以表达很多种与多潜能相关的基因，如 Nanog、0ct4、FGF4、Sox_2和碱性磷酸酶。特别地，Nanog、0ct4和Sox-2的表达被广泛认为 是确定一细胞为ES细胞的决定性最初表征。嵌合体的种系传递以及可从三个原胚层（如 内胚层、中胚层和外胚层）产生含有分化细胞的畸胎瘤的能力也被广泛认为是确定一细胞 为ES细胞的决定性指征。
[0012]所述的GSK3抑制因子指的是抑制一或多个GSK3酶的抑制因子。因此，一个GSK3 抑制因子可以抑制一个、几个或所有GSK3酶家族成员。GSK3酶家族广为人知，其包括但 不限于GSK3-a和GSK3-0。已经发现了几种变体（参见Schafferetal.;Gene2003; 302(1-2) :73-81)。在一些实施例中抑制的是GSK3-P，GSK3-a抑制因子也是合适的，总 体上本发明采用的抑制因子可抑制此两种酶。已经知道很多种GSK3抑制因子，例如CHIR 98014、CHIR99021、AR-A0144-18、TDZD-8、SB216763 和SB415286。其它已知的抑制因子在 本发明中也是有益的。此外，GSK3-0活性位点的结构已被表征，与特异和非特异抑制因子 结合的重要残基也已确定（Bertrandetal.;JMolBiol. 2003 ;333(2):393-407)。这种 结构的表征使得人们容易发现更多的GSK抑制因子。
[0013] 一些实施例中的抑制因子特异针对GSK3-0和GSK3-a，实质上并不抑制erk2和 cdc2。通过IC5(I的比率判断，这些抑制因子对人GSK3的抑制活性比对小鼠erk2和/或人 cdc2的抑制活性要高，优选至少高100倍，更优选至少高200倍，最优选至少高400倍。此 处，GSK3IC5Q值指的是人GSK3-0和GSK3-a的平均值。已在特异针对GSK3的CHIR99021和 CHIR98014 中得到了一些好的结果。BennettC等（J.Biol.Chem.，vol. 277,no. 34,August 232002,pp30998-31004)和RingDB等（Diabetes,vol. 52,March2003,pp588-595)已描述 了一些GSK3抑制因子的例子。CHIR99021的合适浓度是0. 01-100iiM，优选0. 1-20iiM，更 优选 0. 3-10iiM。
[0014] 还可以利用RNA介导的干扰技术（RNAi)方便地抑制GSK3活性。通常，一种全部 或部分与GSK3基因互补的双链RNA分子被引入多潜能细胞，从而促进编码GSK3的mRNA分 子的特异降解。这种转录后机制可使目的GSK3基因的表达被削弱或丧失。现已有一些利 用RNAi抑制GSK3的合适技术和操作规程。
[0015] 此处的MEK抑制因子是指一般的MEK抑制因子。因此，所述的MEK抑制因子 是指抑制MEK蛋白激酶家族包括MEK1、MEK2和MEK3的任一成员的任意抑制因子，也指 MEK1、MEK2和MEK3三者的抑制因子。一种MEK抑制因子可抑制一个、几个或所有MEK激 酶家族成员。现有技术已知的合适的MEK抑制因子的例子包括但不限于MEK1抑制因子 PD184352 和PD98059、MEK1 和MEK2 的抑制因子U0126 和SL327、以及那些Davies等（2000) (DaviesSP,ReddyH,CaivanoM,CohenP.Specificityandmechanismofactionof somecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemJ. 351, 95-105)所描述的抑 制因子。特别是，与其它已知的MEK抑制因子相比，TO184352特异性强、效力高。Zhang等 (2000) (Bioorganic&MedicinalChemistryLetters;10:2825-2828)描述了其它MEK及 MEK类的抑制因子。已发现炭疽病的致死因子也具有与ro〇98059类似的抑制MAPKK的活 性（Duesberyetal，1999)。其它合适的MEK抑制因子包括PD032509、U0126、SL327 和 CI-1055。
[0016] 也可以利用RNA介导的干扰（RNAi)方便地抑制MEK激酶活性。通常，一种全部或 部分与MEK基因互补的双链RNA分子被引入多潜能细胞，从而促进编码MEK的mRNA分子的 特异降解。这种转录后机制导致目的MEK基因的表达被削弱或丧失。现有一些利用RNAi 抑制MEK的技术和操作规程。
[0017]其它抑制MEK的方法包括利用一种能抑制或削弱ras/MAPK级联反应中一种成分 活性的化合物。此化合物抑制一或多个有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK)如ERK1和ERK2。 任选地，此化合物通过抑制SHP-2也可达到类似的效果，例如抑制此酶与gpl30的结合。在 一个进一步的实施例中，抑制因子抑制MEK的活性。
[0018] 另外也可通过负调节ras/MAPK级联反应中的一种成分来抑制MEK。MKP-3是一种 MAP磷酸激酶，也是一种已知的ERKs负调节因子，已通过转基因技术将MKP-3引入ES细胞。[0019] 已知一些识别激酶抑制剂包括GSK3抑制剂和MEK抑制剂的检测法。例如，在 Davies等（2000)描述的激酶检测法中，将激酶与肽链底物和放射性标记的ATP-起温育。 激酶通过将底物磷酸化将放射性标记引入底物中。每份反应液都被固定到磷酸纤维素纸 上并用磷酸冲洗以去除多余的ATP。然后检测温育后底物的活性，并由此得出激酶活性。 在含有和不含有待测激酶抑制剂的情况下，可利用这种方法容易地确定相应激酶的活性。 Downey等（（1996)JBiolChem. ;271 (35):21005-21011)也描述了检测激酶活性的方法， 可以识别激酶抑制剂。
[0020] 成纤维细胞生长因子（FGF)受体（FGFR)拮抗剂指能拮抗FGF受体的多肽、小分 子或