一种分离纯化大鼠肺微血管内皮细胞的方法
【专利摘要】一种大鼠肺组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于将胸膜下肺边缘组织用酶消化处理为单细胞悬液，CD31免疫磁珠分选得到目标细胞。取大乳鼠胸膜下肺边缘组织，先用胶原酶II和中性蛋白酶混合液消化制备单细胞悬液，然后与CD31免疫磁珠孵育结合，再利用磁珠分选纯化系统筛选CD31+细胞，磁珠释放液去除CD31+细胞结合的磁珠，获得高纯度的大鼠肺微血管内皮细胞。本发明的优点是通过酶消化制备单细胞悬液和CD31免疫磁珠分选，可以从大鼠肺组织中分离提取到高纯度的微血管内皮细胞。
【专利说明】一种分离纯化大鼠肺微血管内皮细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从大鼠肺组织中分离提取高纯度微血管内皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 微血管内皮细胞位于微血管内表面，是营养物质、致病因子、细胞因子和药物等由 血液循环系统进入血管外组织的必经屏障，功能具有多样性，是凝血、充血、瘀血、水肿、炎 症、免疫、肿瘤发生等基本病理变化的关键调节点。微血管内皮细胞的体外培养为深入了解 其生物学特性提供了重要途径，对研究开发保护和治疗微血管内皮细胞功能障碍所致疾的 途径和药物病具有重要意义。
[0003] 不同组织器官的微血管内皮细胞表型和功能有显著异质性，某一脏器相关生理病 理机制的研究需要培养相应的微血管内皮细胞。尽管当前已有多种动物心、肺、皮肤、脑等 组织器官微血管内皮细胞体外培养的报道，但由于微血管的管径小、分散于组织器官内部， 不能直接灌注消化液或有效分离出微血管段，微血管内皮细胞的分离纯化技术仍是个难 题，难以避免非微血管内皮细胞的污染。
[0004] 肺微血管内皮细胞的体外培养当前主要采取酶消化法和组织贴块法，酶消化法易 于短期内获得大量微血管内皮细胞，但非微血管内皮细胞会均匀混杂其中，单纯的手工操 作难以进行纯化；组织贴块法也因组织样品和处理方法的差异无法确定最佳的去块时间， 难以避免肺微血管内皮细胞的游出而污染。
[0005] 本发明将酶消化法和免疫磁珠技术相结合，可快速从大鼠肺组织中分离、纯化到 高纯度的微血管内皮细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种分离培养高纯度大鼠肺微血管内皮细胞的方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0008] -种从大鼠肺组织分离培养高纯度微血管内皮细胞的方法，其步骤如下。
[0009] A.将大乳鼠断颈处死，剖开胸腔，右心室灌注Hank' S液，无菌取出肺脏，剔除脏 胸膜，剪取肺边缘组织，去除大血管，剪碎为小块；所述右心室灌注Hank' s液于4°C预冷， 灌注至肺脏发白；所述剪碎为小块的体积约为I mm3。
[0010] B.将所述肺组织小块用Hank' s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液为 0. 2%胶原酶！[和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化温度为37°C，消化时间为2(T30 min。将 所述消化后的溶液过200目细胞筛，收集滤液离心，沉淀细胞团用0.01 M PBS重悬为单细 胞悬液；所述离心处理，转速为80(Tl200 rpm，时间为5?10 min;所述0.01 M PBS含有0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA;所述的单细胞悬液密度为IX IO7个/mL。
[0011] C.将所述的单细胞悬液中加入⑶31免疫磁珠，孵育得到细胞-抗体-磁珠复合 物。所述的CD31免疫磁珠为CD31单克隆抗体与磁珠孵育结合获得，温度为4°C，时间为过 夜，密度为4 X IO8个/mL，每毫升单细胞悬液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育处理，置 于旋转摇床，温度为15?25 °C，时间为3(T60 min。
[0012] D.将所述的细胞-抗体-磁珠复合物从未结合磁珠和细胞中分离；所述的分离处 理使用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重复4次，细胞-抗体-磁珠复合物释放于含5%胎牛血清、I mM氯化钙和4 mM氯化镁 的DMHM培养基。
[0013] E.将所述的细胞-抗体-磁珠复合物悬浮液中加入释放缓冲液去除细胞表面结 合的磁珠；所述释放缓冲液为DNase I溶液，每毫升细胞悬液加4 μ L，温度为室温，作用时 间为1〇~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：中速混 合I min，收集2次、每次I s，中速释放3 s ;重复1次。
[0014] F.将所述去除磁珠的⑶31+细胞离心，用完全培养基重悬，接种孵育培养；所述 的离心处理，转速为80(Tl200 rpm，时间为5~10 min;所述的完全培养基为DMEM培养基，含 20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL链霉素；所述的接种培养细 胞密度为IX IO5个/mL。
[0015] G.所述的接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态时传代培养；所 述的传代培养用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脱壁，传代密度 为 IX IO5 个/mL。
【具体实施方式】
[0016] 实施例一。
[0017] 1.主要实验材料。
[0018] ( 1)实验动物：7日龄SD大乳鼠。
[0019] (2) Hank' s 液：购自 GIBCO 公司，货号 14170-112。
[0020] (3) 0· 01 M PBS :取 NaCl 8. 0 g、Na2HP04 2. 9 g、KH2P04 0· 2 g、KCl 0· 2 g，溶解于 1000 mL超纯水中，0. 22 μ m过滤除菌，于4°C冰箱贮存。
[0021] (4)消化液：用0· 01 M PBS配制，含0· 2%胶原酶Π (购自Worthington公司，货号 LS004176)和0. 1%中性蛋白酶Π (购自Sigma公司，货号D4693-1G)，0. 22 μπι无菌滤器过 滤除菌。
[0022] (5)完全培养基：DMEM基础培养基(购自GIBCO公司，货号11960-044)，含20% 胎牛血清(购自GIBCO公司，货号10099-141)、2 mM L-谷氨酰胺(购自GIBCO公司，货号 25030-081 )、1%双抗溶液（100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素，购自GIBCO公司，货号 15140-122)。
[0023] (6)小鼠抗大鼠 CD31单克隆抗体：购自AbD Serotec公司，货号MCA 1334G，规格 为200 μ 1 (含200 μ g)，每25 μ 1磁珠使用0· 5 μ g抗体。
[0024] (7)小鼠 IgG磁珠试剂盒：包括5 ml密度为4X IO8个/mL包被抗小鼠 IgG的磁 珠，3管释放缓冲液成分1 (每管为15000~20000 U冻干DNasel)，及2 ml释放缓冲液成分 2。释放缓冲液的配制为每管成分1加0. 3ml成分2溶解，分装冻存，每毫升样品加4 μ 1。
[0025] (8)样品缓冲液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA，0. 22 μ m无菌滤器过滤除菌。
[0026] (9)磁珠清洗液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白，0.22 μ m无菌滤 器过滤除菌。
[0027] (10) EDTA-胰蛋白酶溶液：用 0.01 M PBS 配制，含 0.005%。
[0028] 2.操作步骤。
[0029] 7日龄大乳鼠5只，断颈处死，剖开胸腔，右心室灌注4°C预冷Hank's液至肺脏发 白，无菌取出肺脏，剔除脏胸膜，剪取肺边缘组织，去除大血管，剪碎为I mm3小块，Hank's液 漂洗，加入消化液37° C消化20 min，至无成形肺组织小块。消化液过200目细胞筛，收集滤 液1000 rpm离心10 min，沉淀细胞团用10 ml样品缓冲液重悬，密度约为I X IO7个/mL。
[0030] 取250 μ 1包被抗小鼠 IgG的磁珠，参照说明书用磁珠清洗液洗涤，重悬于250 μ 1磁珠清洗液，加入5 μ 1小鼠抗大鼠⑶31单克隆抗体，置于旋转摇床于4° C孵育过夜， 用磁珠清洗液洗去未结合抗体，将结合有CD31抗体的磁珠重悬于250 μ 1磁珠清洗液，力口 入所述的10 ml样品缓冲液，置于旋转摇床，于20° C孵育30 min，使细胞与⑶31免疫磁珠 结合为细胞-抗体-磁珠复合物。
[0031] 利用KingFisher 96磁珠分选纯化系统将细胞-抗体-磁珠复合物与未结合的细 胞和磁珠分离，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重复4次，细胞-抗体-磁 珠复合物释放于含5%胎牛血清、I mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基。每I ml毫升 细胞-抗体-磁珠复合物中加入4 μ L释放缓冲液，室温孵育15 min，利用KingFisher 96 磁珠分选纯化系统除去释放的磁珠，程序设置为：中速混合I min，收集2次、每次I s，中速 释放3 s ;重复1次，获得去除磁珠的⑶31+细胞，1000 rpm离心10 min,沉淀细胞团重悬 于完全培养基重悬，按I X IO5个/mL密度接种培养。
[0032] 接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态，用EDTA-胰蛋白酶溶液消 化脱壁和传代，传代密度为IX IO5个/mL。
[0033] 3.培养结果。
[0034] 原代培养的高纯度⑶31+肺微血管内皮细胞在接种7天后生长至汇合状态，细胞 呈短梭形或多角形，细胞核明显，汇合后呈典型的"鹅卵石样"外观，单层镶嵌状排列生长， 见图1。传代培养后，5-7天再次生长至汇合状态，具有良好的生长性能。
[0035] 图1体外培养生长亚汇合状态的肺微血管内皮细胞(标尺为200 μ m)
【权利要求】
1. 一种从大鼠肺组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于：所述的方法 主要涉及动物肺组织的单细胞悬液的制备和⑶31+细胞的免疫磁珠分选，与传统肺组织微 血管内皮细胞分离纯化方法比较具有纯度高的特点。
2. 根据权利要求1所述的一种从动物肺组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其 特征在于该方法包括以下步骤： A. 将大乳鼠断颈处死，剖开胸腔，右心室灌注Hank' s液，无菌取出肺脏，剔除脏胸膜， 剪取肺边缘组织，去除大血管，剪碎为小块；所述右心室灌注Hank's液于4° C预冷，灌注至 肺脏发白；所述剪碎为小块的体积约为I mm3 ; B. 将所述肺组织小块用Hank's液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液为0. 2%胶 原酶II和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化温度为37°C，消化时间为2(T30 min ; 将所述消化后的溶液过200目细胞筛，收集滤液离心，沉淀细胞团用0.01 M PBS重悬 为单细胞悬液；所述离心处理，转速为80(Tl200 rpm，时间为5?10 min;所述0.01 M PBS含 有0. 1%牛血清白蛋白、2 mM EDTA ;所述的单细胞悬液密度为IX IO7个/mL ; C. 将所述的单细胞悬液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到细胞-抗体-磁珠复合物； 所述的CD31免疫磁珠为CD31单克隆抗体与磁珠孵育结合获得，温度为4° C，时间为过 夜，密度为4 X IO8个/mL，每毫升单细胞悬液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育处理，置 于旋转摇床，温度为15?25°C，时间为3(T60 min ; D. 将所述的细胞-抗体-磁珠复合物从未结合磁珠和细胞中分离；所述的分离处理使 用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重 复4次，细胞-抗体-磁珠复合物释放于含5%胎牛血清、I mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM 培养基； E. 将所述的细胞-抗体-磁珠复合物悬浮液中加入释放缓冲液去除细胞表面结合的 磁珠；所述释放缓冲液为DNase I溶液，每毫升细胞悬液加4 μ L，温度为室温，作用时间为 10~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：中速混合1 min，收集2次、每次I s，中速释放3 s ;重复1次； F. 将所述去除磁珠的CD31+细胞离心，用完全培养基重悬，接种孵育培养；所述的离 心处理，转速为80(Tl200 rpm，时间为5~10 min ;所述的完全培养基为DMEM培养基，含20% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL链霉素；所述的接种培养细胞密 度为I X IO5个/mL ; G. 所述的接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态时传代培养；所述的 传代培养用含〇. 05%胰蛋白酶和0. 005% EDTA的0. 01 M PBS溶液消化脱壁，传代密度为 lX105f/mL。
【文档编号】C12N5/071GK104371968SQ201410285772
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】张涛, 姜代勋, 穆祥 申请人:北京农学院