一种发酵生产唾液酸的方法

一种发酵生产唾液酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵生产唾液酸的方法，属于生物工程【技术领域】。本发明是将种子液加入到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，通过补加流加液和过氧化氢溶液的方式连续发酵生产含有聚唾液酸的发酵液，再通过离心分离、乙醇沉淀、过滤的方式获取精制聚唾液酸，再对聚唾液酸进行酸解和结晶，最后洗涤冻干后获得唾液酸粉末。利用本发明所提供的方法生产聚唾液酸的产量可达12.96g/L，较目前已报道的聚唾液酸的最大含量提高了87.28％，聚唾液酸的水解率为95％，纯化后唾液酸的含量达到10.01g/L，纯度达到94.80％，适于产业化推广应用。
【专利说明】一种发酵生产唾液酸的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种发酵生产唾液酸的方法，属于生物工程【技术领域】。 技术背景
[0002] 唾液酸（Sialic acids)是一族神经氨酸的衍生物，最常见的是N-乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid，NANA)，通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸的 主要食物来源是母乳，在牛奶、鸡蛋和奶酪中也存在唾液酸。近年来，唾液酸及其衍生物在 食品、保健品和医药上的应用有着日益广阔的发展前景，尤其是在婴幼儿配方奶粉中的应 用，研究发现，可以通过饮食补充外源性唾液酸以增加脑部唾液酸的含量。这也预示着在婴 儿奶粉，特别是针对早产儿的婴儿奶粉中添加唾液酸将有效地促进他们的神经系统和大脑 的发育，同时进一步影响他们在生长发育早期的智力发育，并且在抗炎、抗病毒、抗癌、抗识 别等方面起着十分重要的作用。
[0003] 近年来，科学家已经发现其具有许多重要的生物学功能，随着研究的深入，其应用 领域也越来越广泛，但唾液酸的国际市场价格较高，国内也没有公开成型的大规模生产方 法，因此生产高产量的唾液酸成为人们急需解决的问题。目前，除了微生物发酵法产唾液酸 夕卜，还有化学合成法、酶合成法、天然产物提取法，但化学合成法反应条件苛刻，收率低，酶 法合成原料要求高，价格较为昂贵，而且唾液酸醛缩酶不易获得，限制了生产规模的扩大， 唾液酸在天然原料中含量比较低，而且组成成分远比发酵液中复杂，分离提纯过程复杂。现 有文献报道的微生物发酵法生产终产物唾液酸因所用的菌株不同，终产物的产量也不同， 1990年，Camino等利用Escherichia coli K92发酵生产聚唾液酸，产量为0. 45g/L ; 1998 年，郭良栋等，用Escherichia coli C-8发酵生产聚唾液酸，产量为1. 200g/L ;2008年， Bastian等利用Escherichia coli K1进行分批补料发酵生产聚唾液酸的产量为1. 600g/ L ;2009年，张琦等，用Escherichia coli K235-WXJ4合成聚唾液酸达到6. 638g/L，纯度 为99. 71 % ;2011年，刘金龙等用Escherichia coli CCTCC M208088合成聚唾液酸量达到 6. 92g/L，纯度达到 99. 9%。
[0004] 聚唾液酸经过酸水解后可得到唾液酸，再经过分离提纯才能得到纯度较高的唾液 酸。目前已报道的相关文献几乎都是检测的聚唾液酸的含量，最大产量为6. 92g/L，没有进 一步的水解，或是水解后直接提纯唾液酸，并没有报道唾液酸的含量。


【发明内容】

[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产唾液酸的方法，该方法显著提高了 唾液酸的产量，所采取的技术方案如下：
[0006] -种发酵生产唾液酸的方法，是将种子液加入到含有灭菌发酵培养基的发酵罐 中，通过补加流加液和过氧化氢溶液的方式连续发酵生产含有聚唾液酸的发酵液，再通过 离心分离、乙醇沉淀、过滤的方式获取精制聚唾液酸，再对聚唾液酸进行酸解和结晶，最终 洗涤冻干后获得唾液酸粉末。
[0007] 所述方法的步骤如下：
[0008] 1)发酵液的制备：将种子液和丙酮酸钠加入到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵 过程中补加过氧化氢溶液和流加液，并不断搅拌，发酵结束后获得发酵液；
[0009] 2)聚唾液酸的提取：离心分离步骤1)所得发酵液，收集上清液并用乙醇溶液沉 淀，离心干燥沉淀物后，再用去离子水复溶，过滤除去不溶物，再次加入乙醇溶液沉淀，离心 后冻干沉淀，获得精制聚唾液酸；
[0010] 3)聚唾液酸的酸解：利用盐酸酸解步骤2)所得精致聚唾液酸，再向水解溶液中加 入冰乙酸结晶，再用冰乙酸洗涤结晶后，真空干燥获得唾液酸。
[0011] 所述方法步骤1)所述种子液制备方法是，从大肠杆菌K235甘油菌中，取100 μ L 接种到5mL种子培养基中，37°C，恒温培养12h，按2%的接种量将培养好的菌液再接种到含 100mL种子培养基的500mL三角瓶中，37°C，250r/min摇床培养12h，按2%的接种量再次接 至IJ 100mL种子培养基中培养8?10h，培养结束后获得发酵种子液；
[0012] 所述种子培养基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，ρΗ7· 2-7. 4 ;
[0013] 所述发酵培养基的配方为25g/L山梨醇，2.5g/L硫酸铵，1.5g/L酵母提取物， 2. 5g/L磷酸氢二钾，0. 9g/L无水硫酸镁，0. 002g/L无水硫酸铜，pH7. 6-8. 0,其余成分为蒸 馏水；
[0014] 所述流加液含有307. 17g/L山梨醇，30. 65g/L硫酸铵，ρΗ7· 6-8. 0。
[0015] 所述方法步骤1)所述丙酮酸钠的添加量为4. 14g/L发酵培养基；所述补加过氧化 氢溶液是分别在发酵5、10、15、20h时按0. 4015、0. 8025、1. 605、1. 605mL/L发酵培养基的添 加量补加；所述补加流加液是在发酵8h时按50ml/L发酵培养基的添加量补加。
[0016] 所述方法步骤1)所述发酵，发酵温度为37°C，发酵时间40h，PH7. 78,通气量IV/ V · min ;所搅拌发酵12h前，搅拌速度为400r/min，发酵12h后，搅拌速度为600r/min。
[0017] 所述方法步骤2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇浓度为75%，添加量为3倍体积 上清液，第二次沉淀乙醇溶液浓度为95%，添加量为3倍体积滤液；所述离心，离心发酵液 转速为8000r/min，离心时间10min，离心乙醇沉淀液转速为10000r/min，离心时间10min。
[0018] 所述方法步骤3)所述酸解是85°C下，用0. 1M盐酸酸解2%的聚唾液酸溶液，酸解 时间2h。
[0019] 所述方法步骤3)所述冰乙酸结晶，冰乙酸添加量为5倍体积的唾液酸单体溶液， 结晶温度为4°C，结晶时间3d。
[0020] 所述方法的具体步骤为：
[0021] 1)将67. 6mL种子液加入到已灭菌的含有2L发酵培养基的发酵罐中，同时加入 8.188丙酮酸钠，并分别在发酵5、10、15、2011后补加0.803、1.605、3.210、3.2101^的过氧化 氢溶液，在发酵8h后补加100mL灭菌流加液，发酵12h前搅拌速度为400r/min，12h后搅拌 速度为600r/min，pH7. 78,在37°C下发酵40h后，获得发酵液；
[0022] 2)将步骤1)所得发酵液在8000r/min转速下离心10min，去除菌体，收集上清液， 向上清液中加入3倍体积的75%的乙醇，100001'/1^11下离心101^11，分离沉淀物并真空干 燥，再将干燥物溶于10倍质量的去离子水中，用1. 5%硅藻土助滤剂过滤，向滤液中加入3 倍体积的95%的乙醇溶液，10000r/min下离心lOmin，冻干沉淀物，获得精制聚唾液酸；
[0023] 3)将步骤2)所得精制聚唾液酸配制成2%的溶液，用0. lmol/L盐酸，85°C下酸 解2h，得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍体积的冰乙酸，4°C下静置，结晶 3d，再将晶桨抽滤除去冰乙酸，得到唾液酸晶体，再用5倍质量的冰乙酸洗涤体积，最后将 晶体在50°C下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。
[0024] 本发明所用发酵的原始菌株为Escherichia coli K235(ATCC13027)。本发明的有 益效果：
[0025] 本发明利用原始菌株Escherichia coli K235(ATCC13027)生产聚唾液酸的产量 为12. 96g/L，较目前已报道的聚唾液酸的最大含量提高了 87. 28%，聚唾液酸的水解率为 95%，纯化后唾液酸的含量达到10. 01g/L，纯度达到94. 80%。本发明所生产的聚唾液酸的 产量具有明显的优势，为其在食品、保健、医药上日益广阔的应用前景提供了有利的条件。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图1为实施例1碳源优化发酵过程中菌体的吸光度；
[0027] (A1，山梨醇浓度30g/L ;A2,山梨醇浓度40g/L ;A3,山梨醇浓度50g/L)。
[0028] 图2为实施例1碳源优化发酵过程中残留山梨醇的质量浓度；
[0029] (A1，山梨醇浓度30g/L ;A2,山梨醇浓度40g/L ;A3,山梨醇浓度50g/L)。
[0030] 图3为实施例1碳源优化发酵过程中唾液酸的质量浓度；
[0031] (A1，山梨醇浓度30g/L ;A2,山梨醇浓度40g/L ;A3,山梨醇浓度50g/L)。
[0032] 图4为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中菌体的吸光度；
[0033] (B1，硫酸铵浓度3g/L ;B2,硫酸铵浓度4g/L ;B3,硫酸铵浓度5g/L)。
[0034] 图5为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中硫酸铵的质量浓度；
[0035] (B1，硫酸铵浓度3g/L ;B2,硫酸铵浓度4g/L ;B3,硫酸铵浓度5g/L)。
[0036] 图6为实施例1无机氮源含量确定发酵过程中唾液酸的质量浓度；
[0037] (B1，硫酸铵浓度3g/L ;B2,硫酸铵浓度4g/L ;B3,硫酸铵浓度5g/L)。
[0038] 图7为搅拌速度对菌体生长的影响；
[0039] (a，同搅拌速率对菌体生长的影响；b，不同搅拌速率下菌体的比生长速率）。
[0040] 图8为搅拌速度对唾液酸产量的影响；
[0041] (a，不同搅拌速率对终产物唾液酸产量的影响；b，不同搅拌速率下终产物唾液酸 的比合成速率）。
[0042] 图9为各因素交互作用对菌体发酵产唾液酸的影响的响应面图和等高线图。
[0043] 图10为唾液酸高效液相色谱检测图；
[0044] (a，唾液酸标准物质的高效液相色谱图；b，唾液酸样品的高效液相色谱图）。
[0045] 图11为发酵液中提取并纯化后的唾液酸红外光谱图。

【具体实施方式】
[0046] 本发明提供了一种发酵生产唾液酸的方法，该方法可大幅提高唾液酸的产量，为 唾液酸在食品、保健、医药等方面的应用提供支持。下面结合实施例对本发明做进一步说 明，但本发明不受实施例的限制。
[0047] 实施例1发酵培养基碳氮源的优化
[0048] 1.发酵培养基碳源含量的确定
[0049] 用单因素实验对碳源山梨醇的三种含量（30、40、50g/L)进行实验，确定合适的碳 源含量，分别命名为A1、A2、A3,发酵培养基中其他成分及含量为：磷酸氢二钾2. 5g/L、硫酸 铵 5g/L、酵母提取物 1. 2g/L、硫酸镁 0· 9g/L、硫酸铜 0· 002g/L，ρΗ8· 0 (121°C，15min 灭菌）。
[0050] 500mL三口烧瓶培养：将培养好的种子液按接种量4% (v/v)接入装有300mL发酵 培养基的500mL三口烧瓶中培养，摇床转速250r/min，温度37°C，培养40h，定时取样，测得 山梨醇的质量浓度和在425nm处的菌体吸光度及唾液酸的质量浓度，用便携式pH计实时监 测，并用4mol/L的氢氧化钠调节发酵液中的pH，使之保持在7. 6?8. 0。
[0051] 放大培养：3. 7L发酵罐装液量为2L，接种量4%，发酵温度37°C，搅拌转速250r/ min，ρΗ8· 0,通气量 1 (V/V · min)，培养 40h。
[0052] 实验结果如图1-3所示。图1为发酵过程中菌体的吸光度，图2为发酵过程中残 山梨醇的质量浓度，图3为发酵过程中唾液酸的质量浓度。从图1-3可以看出，发酵结束 时，A2组菌体吸光度最大，残山梨醇的含量约为15g/L，唾液酸的含量最高为1. 35g/L，因此 选择A2组山梨醇40g/L为发酵培养基碳源含量。
[0053] 2.发酵培养基无机氮源含量的确定
[0054] 在上步优化的碳源含量的基础上，对无机氮源硫酸铵的含量（3、4、5g/L)进行单 因素实验，确定合适的氮源含量，分别命名为Bl、B2、B3,发酵培养基中其他成分及含量为： 山梨醇40g/L、磷酸氢二钾2. 5g/L、酵母提取物1. 2g/L、硫酸镁0. 9g/L、硫酸铜0. 002g/L、 ρΗ8· 0 (121°C，15min 灭菌）。
[0055] 实验结果如图4-6所示，图4为发酵过程中菌体的吸光度，图5为发酵过程中硫酸 铵的质量浓度，图6为发酵过程中唾液酸的质量浓度。从图4可知，B2组菌体吸光度较大， 表明菌体生长较其它两组快，图5中B2组残硫酸铵的含量约为1. 3g/L，图6中B2组唾液酸 的含量较高，因此选择B2组硫酸铵4g/L为发酵培养基氮源含量。
[0056] 3.响应面实验确定碳、氮源的最佳含量
[0057] 将获得的山梨醇和硫酸铵的含量分别为40g/L和4g/L及有机氮源酵母提取物 1. 2g/L，利用Design-Expert7. 0软件对山梨醇40?45g/L、硫酸铵3. 8?4. 3g/L及有机氮 源酵母提取物1?1. 5g/L，三因素进行响应面实验，发酵40h后，分别测唾液酸的含量，选择 能使唾液酸含量较高的碳、氮源含量作为发酵培养基的碳、氮源，实验设计及结果为下表：
[0058] 表IDesign-Expert软件设计的17组实验及实验结果
[0059]

【权利要求】
1. 一种发酵生产唾液酸的方法，其特征在于，是将种子液加入到含有灭菌发酵培养基 的发酵罐中，通过补加流加液和过氧化氢溶液的方式连续发酵生产含有聚唾液酸的发酵 液，再通过离心分离、乙醇沉淀、过滤的方式获取精制聚唾液酸，再对聚唾液酸进行酸解和 结晶，最终洗涤冻干后获得唾液酸粉末。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 发酵液的制备：将种子液和丙酮酸钠加入到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程 中补加过氧化氢溶液和流加液，并不断搅拌，发酵结束后获得发酵液；2) 聚唾液酸的提取：离心分离步骤1)所得发酵液，收集上清液并用乙醇溶液沉淀，离 心干燥沉淀物后，再用去离子水复溶，过滤除去不溶物，再次加入乙醇溶液沉淀，离心后冻 干沉淀，获得精制聚唾液酸；3) 聚唾液酸的酸解：利用盐酸酸解步骤2)所得精致聚唾液酸，再向水解溶液中加入冰 乙酸结晶，再用冰乙酸洗涤结晶后，真空干燥获得唾液酸。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述种子液，制备方法是从大肠杆菌 K235甘油菌中，取100 μ L接种到5mL种子培养基中，37°C，恒温培养12h，按2%的接种量将 培养好的菌液再接种到含l〇〇mL种子培养基的500mL三角瓶中，37°C，250r/min摇床培养 12h，按2%的接种量再次接到100mL种子培养基中培养8?10h，培养结束后获得发酵种子 液； 所述种子培养基含有5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，pH7. 2-7. 4 ;所述发酵培养基的配方为25g/L山梨醇，2. 5g/L硫酸铵，1. 5g/L酵母提取物，2. 5g/L磷 酸氢二钾，0. 9g/L无水硫酸镁，0. 002g/L无水硫酸铜，pH7. 6-8. 0,其余成分为蒸馏水；所述流加液含有307. 17g/L山梨醇，30. 65g/L硫酸铵，pH7. 6-8. 0。
4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述丙酮酸钠的添加量为4. 14g/L发酵 培养基；所述补加过氧化氢溶液是分别在发酵5、10、15、20h时按0. 4015、0. 8025U. 605、 1. 605mL/L发酵培养基的添加量补加；所述补加流加液是在发酵8h时按50ml/L发酵培养 基的添加量补加。
5. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述发酵，发酵温度为37°C，发酵时间 40h，pH7. 78,通气量1V/V · min ;所述搅拌，在发酵12h前，搅拌速度为400r/min，发酵12h 后，搅拌速度为600r/min。
6. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述乙醇溶液，第一次沉淀乙醇浓度为 75 %，添加量为3倍体积上清液，第二次沉淀乙醇溶液浓度为95 %，添加量为3倍体积滤液； 所述离心，离心发酵液转速为8000r/min，离心时间10min，离心乙醇沉淀液转速为10000r/ min，离心时间10min。
7. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述酸解是85°C下，用0. 1M盐酸酸解 2%的聚唾液酸溶液，酸解时间2h。
8. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述冰乙酸结晶，冰乙酸添加量为5倍体 积的唾液酸单体溶液，结晶温度为4°C，结晶时间3d。
9. 权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为： 1)将67. 6mL种子液加入到已灭菌的含有2L发酵培养基的发酵罐中，同时加入8. 18g 丙酮酸钠，并分别在发酵5、10、15、20h后补加0. 803、1. 605、3. 210、3. 210mL的过氧化氢溶液，在发酵8h后补加 lOOmL灭菌流加液，发酵12h前搅拌速度为400r/min，12h后搅拌速度 为600r/min，pH7. 78,在37°C下发酵40h后，获得发酵液；2) 将步骤1)所得发酵液在8000r/min转速下离心lOmin，去除菌体，收集上清液，向上 清液中加入3倍体积的75%的乙醇，1000〇1'/111；[11下离心1〇1]1；[11，分离沉淀物并真空干燥，再 将干燥物溶于10倍质量的去离子水中，用1. 5%硅藻土助滤剂过滤，向滤液中加入3倍体积 的95%的乙醇溶液，100001'/1^11下离心101^11，冻干沉淀物，获得精制聚唾液酸 ；3) 将步骤2)所得精制聚唾液酸配制成2%的溶液，用0. lmol/L盐酸，85°C下酸解2h， 得到唾液酸酸解溶液，向唾液酸酸解溶液中加入5倍体积的冰乙酸，4°C下静置，结晶3d，再 将晶浆抽滤除去冰乙酸，得到唾液酸晶体，再用5倍质量的冰乙酸洗涤晶体，最后将晶体在 50°C下真空干燥4h，得到唾液酸粉末。
【文档编号】C12P19/26GK104046671SQ201410285753
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】刘丽波, 李春, 迟涛, 刘宁, 王敏, 梁婉婷, 祁昕 申请人:东北农业大学