专利名称：一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法， 属生物技术领域。
背景技术：
肺动脉内皮细胞，尤其是远端肺动脉为内皮细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其是 肺动脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。目前培养肺动脉内皮细胞的方法包括酶消 化法和组织块贴片法，动物来源多为牛、猪等大型动物，成本较高、动物质量难以控制 且来源较少，而且组织贴片法培养细胞尚有周期较长、成功率较低的缺点。而大鼠作为 目前生命科学研究领域最常见、最实用、最方便的实验动物，关于以大鼠远端肺动脉为 内皮细胞来源的细胞培养方法却鲜有报道，分析原因主要有以下原因1、大鼠体形较 小，心肺组织更小，用常规分离牛、猪等大型动物远端肺动脉的方法来分离大鼠的远端 肺动脉难度太大、不易成功2.分离到的大鼠远端肺动脉太细，用常规的大血管酶灌注 消化法来培养大鼠远端肺动脉内皮细胞根本行不通。
发明内容
本发明的目的是提供一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法。该培养方法技术稳 定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的远端肺动脉内皮细胞形 态及特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的-
一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，它包括以下步骤组成
(1) 获取远端肺动脉从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉；
(2) 获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞从取得的远端肺动脉中提取远端肺 动脉内皮细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；
(3) 获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞:将步骤(2)中得到的原代细胞用PBS 溶液清洗后，加入0.3 0. 5ml 0. 1% 0.2%胰蛋白酶溶液20 37'C消化2 3分钟， 当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3 5ml混合培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期, 即完成传代细胞培养，获得传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。
所述步骤(3)中的混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和5% 10%胎牛血清的PMRI 1640培养基。
步骤(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0. 1%EDTA,所述的细胞接种密度为1 2X105 个/ml，以保持细胞生长有足够的空间、营养。
所述的步骤(l)中从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉的具体歩骤为
a、 取经腹腔注射150mg/kg戊巴比妥钠麻醉的大鼠心肺组织，用冊SS平衡盐溶液 洗除血污；
b、 将步骤a所得的心肺组织置于显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心 分离远端肺动脉；
c、 用钝头针灸针沿步骤b所得肺动脉的远端开口纵向穿过肺动脉，当远端开口到 达针灸针柄时用显微镊从肺动脉的近端开口将肺动脉翻转固定于针灸针柄，暴露内皮， 两端用细铜丝结扎，剪断针灸针，获取翻转固定于针灸针柄上的远端肺动脉。
其中，步骤a所述的朋SS平衡盐溶液为1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化钠、0. 38g 氯化钾、0. 25g氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。
步骤c中的针灸针的针体直径为0. 22mm，针体长度为40mm。
所述的步骤(2)中获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞的具体步骤为
1) 将所得的肺动脉置于0. 3 0. 5ml消化液中，35 37'C消化3 5分钟；
2) 向步骤1)的消化液中加入lml混合培养液后离心，800 1000r/min离心5-8 分钟，分离出内皮细胞团置于混合培养液T中，制成细胞悬浮液；
3) 将步骤2)所得细胞悬浮液调整细胞密度至1 5X104个/mi，用该细胞悬浮液 以悬浮液的细胞密度为接种密度接种于细胞培养瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中 培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培 养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。
所述步骤l)中的消化液为5ml冊SS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木 瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫苏糖醇配制而成。
所述的步骤2)中的混合培养液为含lOOUAil的青霉素、100U/ml的链霉素和20 X胎牛血清的PMRI 1640培养基。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果
(1) 是借助显微镜、显微镊、显微剪及针灸针等精细工具突破了运用酶消化法培养 小动物远端肺动脉内皮细胞的技术难关，填补了该领域空白。
(2) 是动物来源为常见实验动物大鼠，避免了以往使用牛、猪等大型动物而标本不 易获得、动物质量难以控制、成本较高的缺点。
(3) 是肺动脉内皮细胞的取材部位位于大鼠肺内远端肺动脉，避免了以往多取材于 牛、猪、兔等近端肺动脉的缺点。
(4) 是培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好。
(5) 获得的细胞具有典型的远端肺动脉内皮细胞形态及特点，为进一步深入研究肺 循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压等疾病的发病机制奠定了条件，提 供了丰富的材料来源。
图1是显微镜(100X)下远端肺动脉内皮细胞；
图2是显微镜(200 X)下远端肺动脉内皮细胞；
图3是共聚集荧光显微镜(200X)下远端肺动脉内皮细胞核周胞浆中出现黄绿色的 阳性荧光反应；
图4是透射电镜(16000X)下远端肺动脉内皮细胞具有Webel-Palade小体(W-P小 体)、微丝及吞饮小泡等特征性结构；
图5是透射电镜(20000X)下远端肺动脉内皮细胞具有Webel-Palade小体(W-P小 体)、微丝及吞饮小泡等特征性结构。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明
上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
实施例一-具体步骤
1、 主要实验材料
(1) 、动物来源大鼠可用6 8周龄的SD大鼠。
(2) 、 HBSS平衡盐溶液.-1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0. 38g氯化钾、0. 25g 氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES，实验前24小时配制并过滤除菌。
(3) 、消化液5mlHBSS平衡盐溶液中加入31rag I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg 牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫苏糖醇配制而成。
(4) 、混合培养液I:含20% (ml胎牛血清/100ml培养基)胎牛血清(Gibco， USA) 的PMRI 1640培养基(Gibco， USA)，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。
(5) 、混合培养液II:含5% 10% (ml胎牛血清/100ml培养基)胎牛血清(Gibco， USA)的PMRI 1640培养基(Gibco， USA),并含有100U/ml的青霉素和100U/ral的链霉 素。 .
(6) 、针灸针为国产(苏州天一针灸器械有限公司)，针体直径为0. 22mm，针体长 度为40mm。
2、 操作步骤
(1) 、获取大鼠远端肺动脉
1) 称重大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(150mg/kg)麻醉大鼠，无菌条件下取大鼠心 肺组织，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；
2) 将心肺组织置于外科显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离远端 肺动脉； '
3) 用钝头针灸针沿肺动脉的远端开口纵向穿过肺动脉，当远端开口到达针灸针柄 时用显微镊从肺动脉的近端开口将肺动脉翻转固定于针灸针柄，暴露内皮，两端用细铜 丝结扎，剪断针灸针，获取翻转固定于针灸针柄上的远端肺动脉；
其中，歩骤1)中的朋SS平衡盐溶液为
(2) 、获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
1) 将翻转后暴露内皮的远端肺动脉置于0.5ml消化液中，37'C消化5分钟；
2) 消化液中加入lml混合培养液I后离心，1000r/min离心8分钟，分离出内皮 细胞团置于混合培养液I中，制成细胞悬浮液；
3) 调整细胞悬浮液细胞密度至1X104个/ml，并以该细胞密度为接种密度接种于 细胞培养瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至 对数生长期，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；
(3)、获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0. 5ml 0.2X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 37。C消化3分钟，当细胞出现回缩、细胞间 隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml混合培养液I1，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之 形成细胞悬浮液，以2X105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37t、 5%二 氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠 远端肺动脉内皮细胞。
3、培养结果
(1) 、在倒置相差显微镜下观察，远端肺动脉内皮细胞呈扁平的短梭形或多角形， 细胞大小均一，胞核清晰，呈卵圆形。有核的区域较无核的区域突出，细胞呈典型的单 层"鹅卵石样"或"铺路石样"镶嵌状排列生长。见图1 (100X)和i 2 (200X)。
(2) 、第VI因子相关抗原的免疫荧光检测将细胞接种在盖玻片上，用免疫荧光方 法染色，远端肺动脉内皮细胞核周胞浆中出现黄绿色的阳性荧光反应。见图3 (200X )。
(3) 、透射电镜检测透射电镜下观察到远端肺动脉内皮细胞具有Webel-Palade小 体(W-P小体)、微丝及吞饮小泡等特征性结构(箭头所示)。见图4 (16000X)和图 5 (20000X)。
实施例二
与实施例一不同的是操作步骤中的步骤(2)和步骤(3)中的技术参数不同 (2)、获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
1) 将翻转后暴露内皮的远端肺动脉置于0.3ml消化液中，35'C消化3分钟；
2) 消化液中加入lml混合培养液I后离心，800r/min离心5分钟，分离出内皮细胞团置于混合培养液I中，制成细胞悬浮液；
3)调整细胞悬浮液细胞密度至3X104个/ml，并以该细胞密度为接种密度接种于 细胞培养瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次'，至细胞生长至 对数生长期，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；
(3)、获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0. 3ml 0. 1X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 20'C消化3分钟，当细胞出现回縮、细胞间 隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3ml混合培养液n，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之 形成细胞悬浮液，以1X105个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37。C、 5%二 氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠 远端肺动脉内皮细胞。 .
实施例三
与实施例一不同的是操作步骤中的步骤(2)和步骤(3)中的技术参数不同-
(2) 、获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
1) 将翻转后暴露内皮的远端肺动脉置于0.4ml消化液中，36'C消化4分钟；
2) 消化液中加入lml混合培养液I后离心，900r/min离心7分钟，分离出内皮细 胞团置于混合培养液I中，制成细胞悬浮液；
3) 调整细胞悬浮液细胞密度至5Xl(T个/ml，并以该细胞密度为接种密度接种于 细胞培养瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至 对数生长期，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；
(3) 、获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞
当原代细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞2次，加入0. 4ml 0. 15% (m/v)胰蛋白酶溶液(含0. 1%EDTA) 35。C消化2分钟，当细胞出现回縮、细胞间 隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入4ml混合培养液n，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之 形成细胞悬浮液，以1.5XlCf个/ml细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37'C、 5%二 氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠 远端肺动脉内皮细胞。 .
权利要求
1、一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，它包括以下步骤组成(1)获取远端肺动脉从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉；(2)获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞从取得的远端肺动脉中提取远端肺动脉内皮细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；(3)获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞将步骤(2)中得到的原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml混合培养液，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成传代细胞培养，获得传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。
2、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于所 述步骤(3)中的混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和5 10%胎牛 血清的PMRI 1640培养基。
3、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于步 骤(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0. 1 %的EDTA。
4、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于步 骤(3)中所述的细胞接种密度为1 2X105个/ml。
5、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于所述的步骤(l)中从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉的具体步骤为a、 取经腹腔注射150mg/kg戊巴比妥钠麻醉的大鼠心肺组织，用HBSS平衡盐溶液 洗除血污；b、 将步骤a所得的心肺组织置于显微镜下，用显微镊和显微剪刀f显微镜下小心 分离远端肺动脉；c、 用钝头针灸针沿步骤b所得肺动脉的远端开口纵向穿过肺动脉，当远端开口到 达针灸针柄时用显微镊从肺动脉的近端开口将肺动脉翻转固定于针灸针柄，暴露内皮， 两端用细铜丝结扎，剪断针灸针，获取翻转固定于针灸针柄上的远端肺动脉。
6、 根据权利要求5所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于步 骤a所述的HBSS平衡盐溶液为1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化钠、0. 38g氯化钾、0. 25g 氯化镁、1. 8g葡萄糖和2. 24gHEPES配制而成。
7、 根据权利要求5所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于步 骤c中的针灸针的针体直径为0. 22ram，针体长度为40mm。
8、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于所 述的步骤(2)中获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞的具体步骤为1) 将所得的肺动脉置于0. 3 0. 5ml消化液中，35 37'C消化3 5分钟；2) 向步骤1)的消化液中加入lml混合培养液后离心，800 1000r/min离心5-8 分钟，分离出内皮细胞团置于混合培养液中，制成细胞悬液；3) 将步骤2)所得细胞悬液调整细胞密度至1 5Xl04个/ml，用该细胞悬浮液以 悬浮液的细胞密度为接种密度接种于细胞培养瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培 养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养 的大鼠远端肺动脉内皮细胞。 .
9、 根据权利要求8所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于所 述步骤1)中的消化液为在5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、 10mg牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫苏糖醇配制而成。
10、 根据权利要求8所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于所 述的步骤2)中的混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和20%胎牛 血清的PMRI 1640培养基。
全文摘要
本发明公开了一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其包括以下步骤(1)从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉；(2)从该远端肺动脉中提取远端肺动脉内皮细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；(3)将步骤(2)中得到的原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20℃～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml混合培养液Ⅱ，轻轻吹灯瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成传代细胞培养。本发明方法为进一步深入研究肺循环相关疾病、小血管等相关疾病发病机制奠定了条件，提供了丰富的材料来源。
文档编号C12N5/06GK101195815SQ20071003211
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者冉丕鑫, 卢文菊, 彭公永, 幸 文, 冰 李, 李晓岩, 城 洪, 健 王, 胡锦兴 申请人:广州医学院