专利名称：一种大鼠原代气道上皮细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养方法，是一种大鼠原代气道上皮细胞的培养方法。
背景技术：
气道上皮细胞作为病原微生物及炎症介质的效应细胞，在气道的免疫防御机制中起着重要作用。体外培养的原代上皮细胞广泛应用于呼吸道炎症机制、细胞癌变机制、跨膜离子转运、呼吸道上皮电生理等许多研究领域。大鼠气道上皮细胞原代培养的优点在于以下几个方面1)大鼠作为目前生命科学研究领域最常见、最实用、最方便的实验动物，标本的获取较人标本的获取简单容易；2)人的标本比较珍贵，相关的实验研究可预先在大鼠上皮细胞中进行，在得到一些前期的数据后再回归于人，这样可以有效的保证使用人气道上皮细胞的实验进展顺利。3)采用大鼠·原代气道上皮细胞气液界面培养方法培养出来的细胞，其结构和功能更接近于体内细胞，使得体外实验的结果能够更加真实的反映体内的情况，利于下一步实验的把握。但是，由于大鼠的气道比较小，同时上皮细胞层仅有单层，因此将细胞消化下来存在一定的难度。现今培养大鼠气道上皮细胞的方法较多，包括机械刷洗法、酶消化法和联合消化法。在细胞消化和收集模型的制作时，一般会直接把气道剪开，浸于消化液中消化，然后直接收集消化液中的细胞，这样处理收到的上皮细胞纯度不高，含成纤维细胞多，在培养中又不能有效抑制成纤维细胞的生长，从而影响上皮细胞的培养。另外，机械刷洗法易对细胞损伤大，而酶消化法和联合消化法中使用较多的酶是胰酶和蛋白酶。胰酶对细胞的消化功能较强，消化时间不好控制，对细胞损伤大，影响细胞的活性；蛋白酶法的消化强度较缓和，对细胞的损伤少，但是消化不彻底，消化后获得的细胞较少，影响后续的培养。可见，酶消化法和联合消化法难以保证细胞的活性和数量同时达到较高的水平，后续的培养效果不能达到预期效果。现今的上皮细胞培养主要采用液体界面培养，这样培养的细胞活性较差、分化不完全、细胞寿命短。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、简便、高纯度的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，它包括以下步骤
(1)大鼠气道组织细胞消化采用密闭管腔消化法对离体的已去除血液和里面粘液后且组织细胞具有活性的大鼠气道进行消化处理，使气道的上皮细胞和平滑肌层分离；
(2)收集大鼠气道上皮细胞收集步骤(I)消化处理后的消化液，用基础培养基清洗大鼠气道内壁，所得的消化液和基础培养基混合均匀，经离心获得大鼠气道上皮细胞；
(3)将步骤(2)中收集所得的大鼠气道组织细胞置于铺有胶原蛋白的培养皿中，在37°C,5% CO2常氧环境下静置培养至获得具有纤毛的大鼠原代气道上皮细胞。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(I)的密闭管腔消化法的具体操作为向离体的已去除血液和里面粘液后且组织细胞具有活性的大鼠气道中灌入消化液，至气道中气体排尽时结扎气道远端，然后继续灌入消化液至气道呈充盈状态，封闭气道近端，放入加有基础培养基的培养皿内，4°C静置消化l(T24h，使气道上皮细胞面能与消化液充分的接触；并且在低温的环境下长时间的消化，既可以减少对细胞的损伤，同时能收获较多的细胞。而由于气道外面没有酶液的消化，在收集细胞的时候能减少杂细胞的混入，增加了上皮细胞的纯度。所述的步骤(I)中消化液采用链酶蛋白酶溶液,可以采用链酶蛋白酶与基础培养基混合配制而成。其中，链酶蛋白酶的浓度通常为0. 5mg/ml lmg/ml,视消化情况适当增减。所述的链酶蛋白酶(pronase),为粉剂。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)具体操作为取出经步骤(I)的消化处理的气道，用吸有基础培养基的注射器连接于气道近端，然后剪开远端的结扎线，同时将基础培养基缓慢灌入气道内，将已消化的上皮细胞冲刷下来，并在远端收集气道中的消化液和灌入的基础培养基，离心，弃上清，获得大鼠气道上皮细胞。这样的处理能防止杂细胞的混入，提高上皮细胞的纯度；并且通过培养基的冲刷作用，能使消化的细胞脱落，便于细胞·的收集。本发明中所述步骤(I)和步骤(2)的基础培养基采用DMEM/F-12 (Dulbcco'sModifed Eagle Medium/Factor 12)。所述步骤(3)具体操作为在所获得的大鼠气道上皮细胞中加入含有5%胎牛血清(FBS)的完全培养基使细胞重新悬浮，混匀获得细胞悬液，然后将所述细胞悬液加入包被有胶原蛋白的培养皿内，加入完全培养基，置于37°C、5% CO2常氧环境下静置培养。本发明所述的步骤(3)中的培养皿优选采用插入式培养皿，该插入式培养皿底部铺有胶原蛋白。作为本发明的一个实施方式，插入式培养皿预处理具体操作为在插入式培养皿底部铺150ul浓度为0. 25 lmg/ml的胶原蛋白，在超净台中自然风干后，在UV灯下消毒30分钟，密封，2 8°C保存待用。在所述步骤(3)中，每个插入式培养皿内加入的细胞悬液为200u，所述的完全培养基加入量为500ul。本发明所述步骤⑶中的完全培养基采用50ml含5%胎牛血清(FBS)完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml膜岛素(Insulin)50ul、5mg/ml 全铁转铁蛋白(Holo-Transferrin) 50ul、0. lmg/ml 霍乱毒素(CholeaToxin) 50ul、25ug/ul 表皮生长因子(Epidermal Growing Factor) 50ul、20mg/ml 牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0. 5ml、0. OlM 氢化可的松(Hydrocortisone)I. 5ul、0. OlM 视横酸(Retionic Acid) 0. 25ul> 青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)混合溶液 0. 5ml、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)2.5ml。作为本发明的一种改进，所述步骤(3)中细胞会贴壁并生长，待细胞铺满整个插入式培养皿的底部时，将插入式培养皿内的培养基移去，只在培养皿的外面给予含有5%BSA(Bovine Serum Albumin)无血清完全培养基,从插入式培养皿底部供给营养,形成气液界面培养，在培养期间定期进行细胞换液，将细胞分泌的粘液清除，培养皿的外面则更换新培养基，气液界面培养2 3周，即可获得具有纤毛的大鼠原代气道上皮细胞。
本发明所述步骤(3)中，通过显微镜观察和细胞表面阻力的测定等方法确定细胞是否铺满整个插入式培养皿的底部。而所述的细胞表面阻力的测定采用的是MILLICELLERS-2，通过测定插入式培养皿内外液体之间的阻力来判断细胞生长情况，一般当测得电阻在1000欧姆以上时，说明细胞已经铺满培养皿底部。本发明所述的5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)无血清完全培养基采用50ml含5%BSA无血清完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F-12 46. 5ml、10mg/ml 膜岛素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全铁转铁蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍乱毒素(Cholea Toxin)50ul、25ug/ul 表皮生长因子(Epidermal GrowingFactor) 50ul、20mg/ml 牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0. 5ml>0. OlM 氢化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul、0. OlM 视横酸(Retionic Acid) 0.25ul、青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)混合溶液 0. 5ml、60mg/ml 牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin, BSA) 2. 5ml。本发明所述步骤(3)中在培养期间定期进行细胞换液时，可用PBS冲洗培养皿内·面将细胞分泌的粘液清除。本发明所提供的方法与现有技术相比具有以下有益效果
I.本发明采用的插入式培养皿上铺有胶原蛋白，由于上皮细胞在胶原蛋白层上容易贴壁并且生长状态优于普通的塑料平面，因而以胶原蛋白为支持物有利于上皮细胞的贴壁和增殖，胶原蛋白还能抑制成纤维细胞的生长，可以提高上皮细胞的纯度。2.本发明中链酶蛋白酶的蛋白水解能力弱，采用冷冻消化法，消化时间掌握在l(T24h内能有效的减少成纤维细胞的混杂，既能获得较多的细胞，同时也能保证细胞的活性。3.本发明中气道上皮细胞的消化采用链酶蛋白酶4°C消化过夜，此方法对细胞的损伤少，消化下来的细胞具有状态良好，活性强，易于贴壁，增殖快，不易老化等优点。4.本发明采用的培养基是无血清培养基，可有效减少血清对细胞的毒性，有利于细胞生长、增殖且细胞不易老化，同时，可以通过调节培养基里相关因子的浓度来观察细胞的改变，便于对细胞功能的研究。5.本发明中采用气液界面的培养方法，此方法提供的培养环境更接近体内，使得培养的细胞有良好的活性，有利于细胞的分化和纤毛的形成，保证细胞的数量和质量，便于细胞动力方面的研究。采用此方法培养的气道上皮细胞，其功能更接近在体细胞，为进一步研究呼吸道炎症、呼吸道粘液高分泌以及来源于气道上皮细胞的肿瘤等疾病的发病机制奠定了实验基础，提供了适宜的实验材料来源。因此本法培养出来的细胞能为体外实验提供良好的工具，使得实验的结果更具真实性和可靠性。
图I是普通倒置相差显微镜(40X )下细胞消化下来培养4天后的显微图。图2是普通倒置相差显微镜(40 X )下气道上皮细胞角蛋白免疫组化 其中a :角蛋白免疫细胞染色，DAB显色，上皮细胞的细胞质呈棕黄色；b :为阴性对照。图3是普通正立式显微镜(40X )观察采用插入式培养皿底部膜片制作的石蜡切片的HE染色图。
图4是普通正立式显微镜(100X )观察采用插入式培养皿底部膜片制作的石蜡切片的HE染色图。
具体实施例方式 下面结合实例及附图对本发明作进一步的详细阐述，但本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，结合本领域的普通技术知识和惯用技术手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，可以衍生出其它多种形式的修改、替换或变更。实施例一
(一)主要实验材料 (I)基础培养基DMEM/F-12。(2)含5%FBS完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F_12·46. 5ml> 10mg/ml 膜岛素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全铁转铁蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍乱毒素(Cholea Toxin) 50ul、25ug/ul 表皮生长因子(EpidermalGrowing Factor) 50ul>20mg/ml 牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0.5ml、0. OlM 氢化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul 0. OlM 视横酸(Retionic Acid) 0. 25ul、青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)按体积比I: I混合的溶液0. 5ml、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)2.5ml00(3)含5%BSA无血清完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F-12 46. 5ml、10mg/ml 膜岛素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全铁转铁蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍乱毒素(Cholea Toxin) 50ul、25ug/ul 表皮生长因子(EpidermalGrowing Factor) 50ul、20mg/ml 牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0.5ml、0. OlM 氢化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul、0. OlM 视横酸(Retionic Acid) 0. 25ul、青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)按体积比1:1混合的溶液0. 5ml、60mg/ml牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA) 2. 5ml。(4)消化液链酶蛋白酶(pronase)，为粉剂，采用DMEM/F-12对其进行溶解，配置成浓度为0. 5mg/ml工作液。(5) 细胞培养皿插入式培养皿，事先在每个皿内加入150ul浓度为0. 5mg/ml的胶原蛋白进行包被，将其晾干后在UV灯下消毒30分钟，密封后置于2l°C保存待用。(6)细胞表面阻力测定MILLICELL ERS-2。( 二)操作步骤 获取大鼠原代气道上皮细胞
(I)大鼠气道组织细胞消化取离体的组织细胞具有活性的大鼠气管，冲洗干净内外的血液及内壁的粘液，将已装有Iml消化液的注射器与硅胶管相连，然后将其内的消化液缓慢注入气管。当消化液充满整条气管段时将远端结扎，继续注入消化液使其达到一个合适的充盈状态后堵塞硅胶管口，使气道内的消化液无法漏出。将取得的气管段标本放入加有基础培养基的细胞培养皿中，于4°C消化10 24h。(2)收集大鼠气道上皮细胞取出消化过夜的气管段，弃去过夜培养基，使用新基础培养基将气管段外壁冲洗3次，打开硅胶管口，并连接装有IOml基础培养基的注射器，然后剪开气道远端结扎处，收集消化液，并通过注射器把基础培养基注入气管，将消化的上皮细胞冲刷下来，将消化液和基础培养基混合均勻后置于在15ml的离心管中，1000rpm/min离心5min后,弃上清,获得大鼠气道上皮细胞。(3)培养具有纤毛，功能更接近体内细胞的大鼠原代气道上皮细胞
在细胞沉淀中加入3ml的含5%FBS完全培养基使细胞重新悬浮，混匀，将混匀后的细胞悬液加入包被有胶原蛋白的插入式培养皿内，每个插入式培养皿约加入200ul细胞悬液，每个培养皿外加入500ul完全培养基，置于37°C、5% CO2常氧细胞培养箱内静置培养，细胞贴壁后每2天换液一次。消化下来的气道上皮细胞培养约5天后，在倒置显 微镜下可观察到细胞已经铺满整个插入式培养皿的底部，使用ERS-2检测细胞表面的阻力，阻力大于1000欧姆，说明细胞已经覆盖整个培养皿底部，细胞层已可将培养皿内外培养基完全隔离开，此时，将培养皿内培养基移去，只在培养皿外给予含有5%BSA无血清完全培养基，从底部供给营养，形成气液界面培养。一般8天左右细胞即可分泌粘液，因此每次细胞换液时，培养皿内细胞面用PBS冲洗3次，将细胞分泌的粘液去除，培养皿外则只需更换培养基无需冲洗，一般培养2周左右后，细胞上层粘液洗去后，可于40高倍倒置显微镜下可观察到纤毛摆动。(三)培养结果
(I)倒置相差显微镜下观察，刚接种的细胞圆形、透亮，呈团状，并且由于纤毛的摆动，细胞团不断的游动和翻滚；一般接种培养2 3天后，大部分细胞已经贴壁，展开的细胞呈形态多样、大小较均一、铺石路样片状生长；继续培养，散在的片状细胞团将慢慢汇合，一般5飞天可以铺满整个培养皿，并最终连成一片将培养皿的底部全部覆盖(图I);培养3周后的原代上皮细胞，用PBS冲洗去除细胞分泌的粘液后，在40高倍倒置显微镜下观察，可以见到纤毛的不规则摆动，并且，随着培养时间的延长，分化出纤毛的细胞的数量将逐渐增加。(2)细胞免疫组化鉴定用羊抗鼠角蛋白单克隆抗体进行免疫组化鉴定，DAB显色。可见，上皮细胞的细胞质呈棕黄色，细胞核为深蓝色(图2)。在光镜下计数阳性着色细胞数。纯度(％)=阳性着色细胞数/细胞总数XlOO %，重复3次取平均值。每张片随机选取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中上皮细胞的纯度，平均达95%以上。(3)将插入式培养皿的底部的膜片取出，按病理切片的方法将其包埋切片，然后进行染色(图3、图4)，图片显示细胞间紧紧相连，细胞成柱状单层生长，细胞核靠近基地部，胞浆丰富。上述实施例只是本发明其中一个实施方式，在本发明中只要在细胞培养时采用包被胶原蛋白的培养皿进行培养，即可获得纯度较高的大鼠气道上皮细胞，所以气道组织细胞消化采用常规机械洗法、酶消化法或胰酶和蛋白酶联合消化法进行消化，采用常规方法收集大鼠气道上皮细胞，所得到的培养结果与实施例一的培养结果基本相同。消化液的链酶蛋白酶的浓度在0. 5mg/ml lmg/ml范围内，采用0. 5mg/ml、0. 6mg/ml、0. 7mg/ml、0. 8mg/ml、0. 9mg/ml或lmg/ml浓度都可以获得良好的消化结果，获得较多的活性细胞。消化时间在10 24h范围内，对气道组织进行10h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21 h、22 h、23 h或24h消化都能获得较多的活性细胞。本发明所采用的培养基并不仅限于实施例一所列举的培养基，采用可用于上皮细胞培养的常规的培养基，也能够达到良好的培养效果。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。凡是依据本发明的实质技术对以上 实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，包括以下步骤 (1)大鼠气道组织细胞消化采用密闭管腔消化法对离体的组织细胞具有活性的去除血液和里面粘液后的大鼠气道进行消化处理，使气道的上皮细胞和平滑肌层分离； (2)收集大鼠气道上皮细胞收集步骤(I)消化处理后的消化液，用基础培养基清洗大鼠气道内壁，所得的消化液和基础培养基混合均匀，经离心获得大鼠气道上皮细胞； (3)将步骤(2)中收集所得的大鼠气道组织细胞置于铺有胶原蛋白的培养皿中，在37°C,5% CO2常氧环境下静置培养至获得具有纤毛的大鼠原代气道上皮细胞。
2.根据权利要求I所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤(3)具体操作为在所获得的大鼠气道上皮细胞中含有5%胎牛血清的完全培养基使细胞重新悬浮，混匀，然后将混匀后的细胞悬液加入包被有胶原蛋白的培养皿内，加入完全培养基，置于37°C、5% CO2常氧环境下静置培养。
3.根据权利要求I或2所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述的步骤(3)中的培养皿采用插入式培养皿，该插入式培养皿底部铺有胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，每个插入式培养皿内加入的细胞悬液为200u，所述的完全培养基加入量为500ul。
5.根据权利要求4所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤(3)中细胞会贴壁并生长，待细胞铺满整个插入式培养皿的底部时，将内层的培养基移去，只在培养皿的外面给予含有5%BSA无血清完全培养基，从插入式培养皿底部供给营养，形成气液界面培养，在培养期间定期进行细胞换液，将细胞分泌的粘液清除，培养皿的外面则更换
6.根据权利要求I所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤(3)中的完全培养基采用含5%胎牛血清完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml 膜岛素 50ul、5mg/ml 全铁转铁蛋白 50ul、0. lmg/ml 霍乱毒素50ul、25ug/ul表皮生长因子50ul、20mg/ml牛垂体提取物O. 5ml、0. OlM氢化可的松I.5ul、0. OlM视磺酸O. 25ul、青霉素和链霉素混合溶液O. 5ml、胎牛血清2. 5ml ； 所述的5%牛血清白蛋白无血清完全培养基采用含5%BSA无血清完全培养基，即每50ml完全培养基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml胰岛素50ul、5mg/ml全铁转铁蛋白50ul、0. lmg/ml霍乱毒素50ul、25ug/ul表皮生长因子50ul、20mg/ml牛垂体提取物O.5ml,O. OlM氢化可的松I. 5ul、0. OlM视磺酸O. 25ul、青霉素和链霉素混合溶液O. 5ml、60mg/ml牛血清白蛋白2. 5ml。
7.根据权利要求I所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述的步骤(I)中消化液采用O. 5mg/mflmg/ml链酶蛋白酶溶液。
8.根据权利要求I所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤(2)具体操作为取出经步骤(I)的消化处理的气道，用吸有基础培养基的注射器连接于气道近端，然后剪开远端的结扎线，同时将基础培养基缓慢灌入气道内，将已消化的上皮细胞冲刷下来，并在远端收集气道中的消化液和灌入的基础培养基，离心，弃上清，获得大鼠气道上皮细胞。
9.根据权利要求I所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤(I)的密闭管腔消化法的具体操作向离体的组织细胞具有活性的去除血液和里面粘液后的大鼠气道中灌入消化液，至气道中气体排尽时结扎气道远端，然后继续灌入消化液至气道呈充盈状态，封闭气道近端，放入加有基础培养基的培养皿内，4°C静置消化l(T24h。
10.根据权利要求8或9所述的大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述步骤⑴和步骤(2)的基础培养基采用DMEM/F-12。
全文摘要
本发明公开了一种大鼠原代气道上皮细胞的培养方法，包括以下步骤(1)大鼠气道组织细胞消化；(2)收集大鼠气道上皮细胞收集步骤(1)消化处理后的消化液以及清洗的大鼠气道内壁的基础培养基，经离心获得大鼠气道上皮细胞；(3)将步骤(2)中收集所得的大鼠气道组织细胞置于铺有胶原蛋白的培养皿中，在37℃、5％CO2常氧环境下静置培养至获得具有纤毛、功能更接近体内细胞生活状态的大鼠原代气道上皮细胞。本发明可以提高上皮细胞的纯度，细胞具有状态良好，活性强。
文档编号C12N5/071GK102787095SQ20121023324
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者卢文菊, 张晨婷, 张雅洁, 徐小明, 王健 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州医学院第一附属医院