专利名称：体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用的制作方法
体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新
型治疗靶标中的应用
相关申请的交叉引用不适用。
背景技术：
发明领域本发明的另一方面涉及结合市售可得的Transwell的共培养脏，例 如75mm直径的Transwell。这允许在培养皿环境下物理分开两种、三种 或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学 流模式。其他重要的改变包括流入和流出管道以向共培养模型的内和外室 两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和 气体浓度。贴壁细胞通过人工Transwell膜以及Petri皿的底部的物理分离 允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因 等)。涉及本发明的多种实施方案的一些示例性新方面包括但不限于下 述(没有指定的顺序)该装置可以以最高水平的保真性来复现在对动脉粥样硬化敏感和 有防御性的动脉循环中以及来自对其他生理(例如锻炼)或病理状况(例 如高血压、糖尿病、血脂异常)敏感的患者的血液动力学剪切应力镨。
该装置可以用作血管生物模拟细胞培养模型用于调查血-脑屏障。例
如，可将内皮细胞在Transwell膜的内表面铺板接种和/或将神经l^t细胞
和/或星形细胞和/或神经元在Transwell膜的反面和/或底部的Petri皿表面
铺板接种。该装置可以用作气道生物模拟细胞培养模型用于调查哞喘的发展 和进程。例如可将上皮细胞在Transwell膜的内表面铺板接种和/或将平滑 肌细胞在Transwell膜的反面铺板接种和/或将巨噬细胞(或白细胞)接种 在下室。通过紧密接近于推台和上皮表面之间的分泌和/或人工粘膜层的推 台的移动仿效节律性呼吸模式。
0028]该装置可以用作肾脏生物模拟模型用于调查内皮细胞和上皮足细 胞相互作用。该装置可以用于确定取自具有与药物毒性或一些病理生理端点相 联系的经鉴定基因型的患者的血管细胞或其他器官细胞类型中的功能性改 变。例如，可以将取自具有鉴定为与药物毒性相关的单核苷酸多态性(SNP) 患者的内皮细胞用于检测对于在毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细 胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性方面有改变的新型或已知化合物。 这通常称作药物基因组学。
图12示出示例性蛋白质分析的结果；
图13示出标准化的mRNA表达的示例性图；0047图14示出标准化的mRNA表达的示例性图；
图7示出对于所分析的细胞数标准化的EC SF的分布。当暴露于 防止动脉石更化的流动时，EC的对齐与流动方向一致(相对于流的角度=8.6 ± 4.01。；图8)，而在倾向于动財"更^化的流下，由于圆形的形态而不能测 量到EC优选的极性。暴露于倾向于动l^f更化的流的Transwell上的SMC(SF = 0.26 ± 0.009)相比于暴露于防止动脉硬化的流的那些(SF = 0.31 ± 0.018;图6和7) 在伸长上显示了重要的树艮小的增加。引起兴趣的是，防止动乐M更化的流 中的SMC —贯性地更加朝向相对于流动方向的垂直方向而对齐(图8和 9)，而相反，在倾向于动脉硬化的条件下的SMC展示了更加随意、更少 协调的定向(分别是画47.9士1.30对-13.1 ± 5.00， P < 0.0001)。图6示出了 相对于流的SMC定向的代表性图像，而图9示出了 SMC定向的直方图分 布。引起最大兴趣的是EC静止标记和SMC收缩标记的减少与若干促 炎性基因的上调相符合。在EC和SMC中，VCAM-1在mRNA和蛋白质 水平都显著上调(图14和15)。在EC中也观察到mRNA水平上IL-8 的显著增加，NF-kB活化的下游促炎性基因。进一步测量来自EC和SMC层的IL-8的分泌作为应用两种流模式期间的时间函数并且只在倾向于动J5^更化的流的较后时间点期间在EC中显著增强IL-8分泌(图16 )。相反，在SMC中同时观察到IL-8和MCP-1的减少(图14 )。最后，增殖标记PCNA的分析显示了在暴露于倾向于动脉硬化的流的EC中增加的蛋白质水平，但对于SMC，则没有变化(图15)。药物
[00115药物可选自下组，该组包括方文线菌素D、巴马司他(batimastat)、c- myc 反义物、地塞米松(dexamethasone)、紫杉醇、紫杉烷、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和依维莫司(everolimus)、未分级的肝素(unfractionated heparin)、低分子量肝素、依诺肝素
(enoxaprin)、比伐卢定(bivalirudin)、酪氨酸激酶抑制剂、格列卫
(Gleevec)、渥曼青霉素(wortmannin ) 、 PDGF抑制剂、AG 1295、 rho激酶抑制剂、Y27632、钙通道阻断剂、氨氯地平(amlodipine)、硝苯地平(nifedipine)、以及ACE抑制剂、合成的多糖、噻氯匹定(ticlopinin )、双嘧达莫(dipyridamole)、 氣p比格雷(clopidogrel )、磺达肝素
(fondaparimix )、链激酶、尿激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、rt-PA、 APSAC、TNK-rt-PA、瑞替普酶(ret印lase)、阿替普酶Ulteplase)、孟替普酶
(monteplase)、兰替普酵(lanoplase )、中白米普酵(pamiteplase )、葡萄球菌激酶、阿昔单抗(abciximab)、替罗非班(tirofiban)、奥波非班
(orbofiban)、珍米洛非班(xemilofiban )、西拉非班(sibrafiban )、罗西非班(roxifiban)、抗再狭窄剂、抗血栓形成剂、抗生素、抗血小板剂、抗凝血剂、抗炎剂、抗瘤剂、抗高血压剂、螯合剂、青霉胺、三乙烯羟化四甲胺、EDTA、 DMSA (二巯丁二酸)、去铁胺甲磺酸酯、降胆固醇剂、斯达汀(statin)、升高的HDL试剂、环加氧酶(cycly oxygenase)抑制剂、西乐葆(Celebrex)、万络(Vioxx)、放射性造影剂、放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗性药物递送微球或微珠，以及其任何组合。
[00116对于本领域技术人员将容易地产生其它优点和改变。因此，本发
案。因此，可进行多种改变而不背离如所附权利要求及其等效物限定的总体发明理念的精神或范围。
权利要求
1.一种用于向培养中的细胞施加血液动力学模式的方法，所述方法包括步骤将第一组细胞在Transwell上铺板接种；将第二组细胞在所述Transwell上铺板接种，其中所述第一组细胞与所述第二组细胞分开；向所述Transwell中加入流体；造成所述流体旋转一段时间，其中所述培养基因此对所述第二组细胞施加剪应力。
2. 权利要求l的方法，其中所述第一組细胞和所述第二组细胞由膜分开。
3. 权利要求l的方法，还包括孵育所述第一组细胞的步骤。
4. 权利要求3的方法，还包括孵育所述第二組细胞的步骤。
5. 权利要求l的方法，还包括将第三组细胞铺柘^接种。
6. 权利要求5的方法，其中将所述第二组细胞在Petri皿底部铺板接种。
7. 权利要求l的方法，还包括周期性地加入额外的所述流体以及周期 性地从Transwell除去一部分所述流体的步骤。
8. 权利要求1的方法，还包括连续加入额外的所述流体以及连续从 Transwell除去一部分所述流体的步骤。
9. 权利要求l的方法，其中所述流体包括药物。
10. 权利要求1的方法，还包括在所述一段时间后分析所述第一组细 胞和所述第二组细胞的步骤。
11. 权利要求1的方法，其中所述旋转力对应于早前测量的血液动力 学模式。
12. 权利要求1的方法，其中所述第一组细胞由内皮细胞或平滑肌细 胞组成。
13. 权利要求1的方法，其中所述第二组细胞由内皮细胞或平滑肌细 胞组成。
14. 一种向培养中的细胞施用血液动力学模式的方法，所述方法包括 步骤监测受试者的血液动力学模式； 将所i^jk液模式模型化成一组电指令；使用一种装置根据所述电指令在Transwell上的多组细胞上造成剪切 应力。13. 权利要求14的方法，其中所述监测步骤包括超声的使用。14. 权利要求14的方法，其中所述监测步骤包括磁共振成像的使用。
15. 权利要求14的方法，其中所述剪切应力在一段时间与所述血液动 力学模式一起变化。
16. —种血液动力学流动装置，包括 电控制器；马达，其中所述马达通过所述电控制器来操作； 与所述马i^目连的推台，从而通过所述马达转动所述推台；具有膜的Transwell,其中所述稚台至少部分浸入到所述Transwell的培养基中并且其中所述推台对所述培养基施加旋转力； 向所述Transwell加入培养基的流入管；以及 从所述Transwell取出培养基的流出管。
17. 权利要求16的装置，其中所述Transwell可以在膜的任一侧接受 一组细胞。
18. 权利要求17的装置，其中所述Transwell可以在Petri皿的底部接 受其它组的细胞。
19. 权利要求17的装置，其中所述培养基对所述组的细胞施加剪应力。
20. 权利要求16的装置，其中所述培养基包括至少一种药物。
全文摘要
本发明涉及用于将人体循环模型化后的血液动力学(即血流)模式施加于培养中的人类/动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现了使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体(即细胞培养基)中并且达到密切接近在平板表面生长的细胞表面。椎台的转动将动量传感到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。这一模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞(血管内衬的细胞)的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动式的流装置的局限性。本发明的另一方面涉及结合Transwell的共培养皿。这允许在培养皿环境下物理分离两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括定制的流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。通过人工Transwell膜以及Petri皿的底部的贴壁细胞的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因等)。
文档编号C12Q1/02GK101680018SQ200880007760
公开日2010年3月24日 申请日期2008年1月10日 优先权日2007年1月10日
发明者B·布莱克曼, B·瓦姆霍夫 申请人:海莫希尔有限责任公司