一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体及其应用。

背景技术：

肝素结合表皮生长因子 (heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)是一个22KD，O-糖基化的蛋白质，属于EGF家族中的一员，对成纤维母细胞、平滑肌细胞和上皮细胞等具有促有丝分裂作用。HB-EGF参与很多生理过程，也跟许多病理过程有关，如伤口愈合，眼睑形成，胚胎植入，心脏发育；也跟许多病理过程有关，如动脉粥样硬化，平滑肌增生，脑损伤以及肿瘤发生。

越来越多的证据显示HB-EGF信号通路的异常调节与多种癌症的发生发展有关，其中主要引发癌症的机制有促进肿瘤生长、血管生成以及肿瘤的转移和侵袭，所以抑制或中和HB-EGF的活性是治疗很多癌症的措施。恶性卵巢癌病人腹水促进细胞增殖能力比良性卵巢肿瘤病人和正常人腹水的促进细胞增殖能力高很多，而且它们的活性仅仅使用EGFR和HB-EGF抗体就能被抑制。恶性卵巢癌病人腹水中的细胞存活率相对于后两者也大大提高，而且同样受到HB-EGF抗体的抑制。HB-EGF抗体降低了恶性胶质瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞的增殖；识别sHB-EGF并对其有高度亲和力的抗体Y-142 抑制卵巢癌细胞系SKOV3、乳腺癌细胞系T47D、结肠癌细胞系SW480中 HB-EGF 诱导的VEGF的产生和血管生成，且抑制效果比EGFR抗体西妥昔单抗和白喉毒素无毒突变体CRM197的效果好。

目前研发和临床研究中的卵巢癌的靶向治疗药物主要有靶向性受体阻断剂，肿瘤血管生成抑制剂以及针对卵巢癌、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）和基质金属蛋白酶的单克隆抗体或嵌合抗体，但未有大规模的临床应用。

此外，临床实验证明，HB-EGF的表达水平增高与病人的临床预后和抗化疗形成密切相关。HB-EGF有可能调节抗细胞凋亡效应如ERK-和Akt-信号通路，或促细胞凋亡效应JNK- 和 p38-信号通路，从而导致细胞化疗抗性的产生。由于HB-EGF的表达和成熟都可以被溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA)的活化特异性调控，且sHB-EGF作为分泌因子很容易被检测到，因此HB-EGF被认为是辅助抗LPA治疗手段中的生物标志物，目前市场上也有多家公司的ELISA试剂盒可进行HB-EGF的检测。

目前不管是临床还是科研用ELISA试剂盒中所用HB-EGF抗体都是源自传统多克隆和单克隆抗体，或者人鼠嵌合抗体，这些抗体稳定性差，生产成本高，对于临床治疗和检测都有所限制。1993年比利时科学家首次在Nature报道：骆驼血液中的一种缺失轻链的抗体能够像正常抗体一样与抗原等靶标高亲和力结合，且不像单链抗体（scFV）一样容易聚集。这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规CH2，CH3区，原核表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性和结合活性，分子量更小，只有正常抗体的1/10，所以VHH（单域抗体）也称为Nanobody（纳米抗体）。将单域抗体VHH表达在噬菌体表面，经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体，这就是噬菌体抗体库技术。这是一种极为高效的抗体表达、筛选体系，所以用其筛选生产单域抗体，周期更短，稳定性更好，可溶性高，可用大肠杆菌发酵生产，成本更低，具有广阔的前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种针对肝素结合表皮生长因子的单域抗体，同时提供该单域抗体的编码序列及该单域抗体在制备检测以及抑制肿瘤的应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体（Dab），其VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4序列片段；

所述互补决定区CDR包括SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3的序列片段；

优选地，所述的肝素结合表皮生长因子的单域抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体，它是针对肝素结合表皮生长因子表位的单域抗体，包括具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明还提供了一种DNA分子，它编码本发明所述的肝素结合表皮生长因子的单域抗体VHH链的蛋白质或本发明所述的肝素结合表皮生长因子单域抗体的蛋白质。

优选地，所述的DNA分子，具有SEQ ID NO：9的DNA序列。

本发明还提供一种表达载体，所述载体为能够表达本发明所述单域抗体的重组载体

pET28a-Dab，所述载体包含SEQ ID NO：9所示的DNA序列。

本发明还提供一种宿主细胞，所述细胞含有本发明所述的表达载体，具有表达本发明

所述单域抗体的能力。

本发明还提供了所述的肝素结合表皮生长因子单域抗体用于检测肝素结合表皮生长因子的用途，所述用途为单域抗体在制备检测肝素结合表皮生长因子ELISA试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述的肝素结合表皮生长因子单域抗体用于抑制癌细胞迁移和浸润的应用，以及在制备抑制癌细胞迁移和浸润的药物中的应用。

所述的序列信息如下：

SEQ ID NO. 1：MKKLLFAIPLVVPFYAAQPAMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

SEQ ID NO. 2：MGWVRQAPGKGLEWVSS

SEQ ID NO. 3：YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

SEQ ID NO. 4：WGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA

SEQ ID NO. 5：GVIFITYD

SEQ ID NO. 6：INTNNGST

SEQ ID NO. 7：ATGGWYGHKRLDSAHLRS

SEQ ID NO. 8：

MKKLLFAIPLVVPFYAAQPAMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVIFITYDMGWVRQAPGKGLEWVSSINTNNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGGWYGHKRLDSAHLRSWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA

SEQ ID NO. 9：

ATGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTATCTTTATCACTTACGATATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGCATTAATACCAATAACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGACTGGGGGTTGGTATGGGCATAAGAGGCTGGATTCCGCGCACTTGAGGTCTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTCGGCCGCACATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG

与现有技术相比，本发明的优点如下：

利用噬菌体筛选技术筛选得到针对肝素结合表皮生长因子的单域抗体基因序列，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的单域抗体株。纯化得到的单域抗体能够结合肝素结合表皮生长因子，并在体外能够抑制卵巢癌细胞的迁移和浸润。该发明肝素结合表皮生长因子单域抗体，大小较小，稳定性好，容易运输，体内也易于穿透细胞；易于实现规模化生产，过程耗时短，成本低，操作易行，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为噬菌体单域抗体库筛选流程图，其中A为以HB-EGF为靶分子，用噬菌体单域抗体

库与预先固定好的靶分子结合；B洗掉未结合的噬菌体；C用胰蛋白酶将特异性结合的噬菌体从靶分子上切割下来；D将洗脱下来的噬菌体扩增后进行下一轮筛选；E按照A、B、C、D进行3轮淘筛，最终富集到与靶分子特异性结合的噬菌体并测序获取核酸序列；图中，表示噬菌体，表示噬菌体单域抗体库，表示HB-EGF靶分子，表示与靶分子特异性结合的噬菌体。

图2是用噬菌体的酶联免疫法（ELISA）鉴定特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将HB-EGF偶联在酶标板上，2是单域抗体，3是鼠抗Myc抗体，4是山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记抗体，5是辣根过氧化物酶显色液TMB；左边无色圆圈表示未显色底物，右边黑色圆圈表示被过氧化物酶催化后显色。

图3是表达的HB-EGF单域抗体，经Protein L亲核层析纯化后的SDS-PAGE电泳图；其中泳道M为蛋白分子标准；泳道1为HB-EGF单域抗体表达菌全菌裂解物；泳道2为未结合Protein L亲和介质的流出样品；泳道3，4，5，6为用平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄,0.15 M NaCl,pH 7.0）洗涤介质流出样品；泳道7，8为用洗脱缓冲液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脱下来的单域抗体。

图4是将生物素化的HB-EGF单域抗体用于HB-EGF的ELISA检测结果。HB-EGF+DAb表示用HB-EGF作为抗原，单域抗体DAb作为一抗；SKOV3+DAb表示用卵巢癌细胞SKOV3裂解物作为抗原，单域抗体DAb作为一抗；DAb表示不加入抗原直接加入DAb的阴性对照。

图5为HB-EGF单域抗体对于卵巢癌SKOV3细胞的浸润抑制试验结果；图中a为对照组（不加试剂），b为实验组（加入200μL实施例3中纯化好的HB-EGF单域抗体（Dab），终浓度为30μg/mL）。

图6为HB-EGF单域抗体为对于卵巢癌SKOV3细胞的浸润抑制试验定量结果。

图7为HB-EGF单域抗体对卵巢癌细胞SKOV3的迁移抑制试验结果。

图8为单域抗体对SKOV3细胞划痕实验迁移速率的影响折线图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：针对肝素结合表皮生长因子的单域抗体筛选

(1)将100μg/mL编码肝素结合表皮生长因子氨基酸第63-149位的部分蛋白（P6018，购自于亚诺法生技股份有限公司）用PBS包被在Nunc的免疫管中，4℃放置过夜。

（2）第二天加入5mL 5%脱脂牛奶，室温封闭2小时；

（3）2小时后加入1mL单域抗体噬菌体展示库（6001_hDAb，购自于英国Source Biosciences公司），室温下孵育1小时；

（4）用PBST（含0.05%吐温20的PBS，SN330-2，购自于南京生兴生物技术有限公司）洗20遍；

（5）加入100μg/mL胰蛋白酶（T1426，购自于sigma公司）室温孵育1小时，加入的胰蛋白酶溶液需要充满整个免疫管，获得与HB-EGF特异性结合的噬菌体，并感染对数生长期的大肠杆菌TG1（6001_hDAb，购自于英国Source Biosciences公司），产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选；

（6）在不断筛选过程中，阳性克隆不断富集，从而达到了利用噬菌体展示技术淘筛抗体库中HB-EGF特异性单域抗体的目的。

实施例2：用噬菌体的ELISA筛选特异性单阳性克隆

（1）从实施例1中富集的噬菌体克隆中，挑选96个单菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基（1L TB培养基中含2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油）中，至对数生长期后，加重浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜；

（2）培养上清转移到经肝素结合表皮生长因子氨基酸第63-149位的部分蛋白（ P6018，购自于亚诺法生技股份有限公司）包被的ELISA板中（该孔为样品孔，对照孔是加入PBS替代培养上清），在室温下放置1小时；

（3）用PBST洗去未结合抗体，加入一抗mouse anti-myc 9E10 antibody（抗myc鼠抗，购自Santa Cruz生物技术公司），在室温下放置1小时；

（4）PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse HRP conjugated secondary antibody(羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗，购自武汉三鹰生物科技有限公司)，室温下放置1小时；

（5）PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶底物TMB（购自于KPL公司）反应30分钟，加入盐酸，于450nm下读数。样品孔OD大于对照孔3倍以上判为阳性克隆。

（6）将阳性克隆在含有100μg/mL的LB液体培养基中培养提取质粒进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI及IMGT分析软件分析基因序列，解析其FR区域和CDR区域，并获得单域抗体VHH链氨基酸序列。

实施例3：单域抗体在大肠杆菌的表达纯化

（1）将测序分析获得的单域抗体核苷酸序列克隆至表达载体pET28a（购自于Life Technology公司），形成能够表达单域抗体的原核表达重组质粒pET28a-Dab，并将测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21（DE3）（购自于Life Technology公司）中，涂布在含100μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜；

（2）挑选单菌落接种在3mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养过夜；

（3）接种2mL过夜菌种至200mL LB培养基中，37℃培养至OD值达到0.5，加入IPTG，28℃培养过夜；

（4）离心收菌，菌体破碎，经Protein L亲和层析柱纯化蛋白，用洗脱缓冲液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脱单域抗体。图3是表达的HB-EGF单域抗体，经Protein L亲核层析纯化后的SDS-PAGE电泳图，图3泳道M为蛋白分子标准；泳道1为HB-EGF单域抗体表达菌全菌裂解物；泳道2为未结合Protein L亲和介质的流出样品；泳道3，4，5，6为用平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄,0.15 M NaCl,pH 7.0）洗涤介质流出样品；泳道7，8为用洗脱缓冲液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脱下来的单域抗体。图3表明筛选到的HB-EGF单域抗体能够通过大肠杆菌系统大量表达，并通过L蛋白进行纯化，所获得的单域抗体蛋白的纯度大于70%。通过此方法获得抗体简单地获得大量目标抗体，成本低廉。

实施例4：应用单域抗体ELISA检测HB-EGF分析

（1）HB-EGF单域抗体的生物素化：将纯化好的单域抗体测定浓度。用DMF将BNHS（H1759，购自于sigma公司）配成1mg/mL溶液，再用0.1mol/L pH9.0的NaHCO₃将单域抗体稀释成1mg/mL，按BNHS：抗体体积比1：8～1：15震荡混匀，室温静置3～4小时，4℃透析过夜。

（2）将购买的HB-EGF多抗（LS-C166803/44318，Lifespan，美国）包被在酶标板上，再分别加入HB-EGF抗原、卵巢癌SKOV3细胞裂解物及不加任何物质作为阴性对照，室温下放置1小时；

（3）用PBST洗涤，并加入步骤（1）获得的生物素化HB-EGF单域抗体；

（4）PBST洗去未结合抗体，加入HRP标记的链酶亲和素（016-030-084，购自于Jackson ImmunoResearch Laboratiories公司）作为二抗，孵育1小时；

（5）PBST洗涤，加入TMB底物（购自于KPL公司）反应30分钟，加入硫酸，450nm处读取OD值。

结果如图4所示，图中HB-EGF+DAb表示用HB-EGF作为抗原，单域抗体DAb作为一抗；SKOV3+DAb表示用卵巢癌细胞SKOV3裂解物作为抗原，单域抗体DAb作为一抗；DAb表示不加入抗原直接加入DAb的阴性对照。结果显示本发明纯化获得的单域抗体可以用于ELISA方法检测HB-EGF抗原以及类似SKOV3细胞裂解物这样含HB-EGF的样品中的HB-EGF含量。

实施例5：细胞迁移实验

（1）制备卵巢癌细胞SKOV3悬液：用PBS（SN330-2，购自于南京生兴生物技术有限公司）清洗SKOV3细胞，吸走PBS，加胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美国）消化，用含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基（均购自于Gbico公司）吹打混匀，终止消化，离心吸走上清液，用含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基重悬细胞，稀释相应倍数后，调整细胞密度至2×10⁵个/mL，使用血球计数板对细胞进行计数，调整细胞密度至2×10⁵个/mL。

（2）接种细胞：将调整好后的细胞悬液吹打混匀，各取200μL分别加入实施例3中纯化好的HB-EGF单域抗体作为实验组（终浓度为30μg/mL）及不加试剂作为对照，加入到Transwell小室（购自于Corning公司）中，最后在小室底部加500μL含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基，按照正常细胞培养规则培养，定期观察。

（3）结果统计：用镊子夹出小室，用棉签轻轻擦去剩余在上室内的贴壁细胞。再用0.1%结晶紫（国药集团化学试剂有限公司）染色15-20分钟，用PBS洗3遍。然后取一干净载玻片，表面滴一滴清水，将Transwell小室放在清水上就可清楚看到小室底膜下室侧附着的细胞，用显微镜观察和拍照，随机选5-10个视野拍照。最后收集图片，统计分析。

实验结果如图5，图6，将Transwell小室下室进行计数，对于卵巢癌细胞SKOV3，经过三次独立实验，将对照组(control)和实验组（DAb）迁移的细胞数进行百分比对比分析，结果表明单域抗体处理过的SKOV3细胞透过Transwell小室的数目明显减少，表明单域抗体可以显著降低卵巢细胞SKOV3的浸润，具有统计学意义。图6是将图5结果数字定量的结果，可以明显的看出单域抗体对卵巢癌细胞SKOV3的迁移抑制作用显著，其差距具有统计学意义（P<0.01），表明我们筛选到的HB-EGF抗体能够显著地抑制卵巢癌细胞SKOV3的浸润。

实施例6：细胞划痕实验

（1）种板：将T25瓶SKOV3细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，146g离心5分钟，弃上清，加含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，取0.5mL到EP管，用枪吸取10μL与细胞计数板上计数。每孔种4000个细胞，于V形槽内混匀。种到24孔板中，实验组（DAb）中加入单域抗体至终浓度为100μg/mL，对照组不加单域抗体，正常培养细胞。

（2）划痕：用10μL白色枪头尽量垂直于孔表面划直线，划两条直线呈十字状。划完开始拍照（0h），以后每过6h就拍一次照，直至划痕愈合为止。最后采集图片，统计分析。

SKOV3细胞经过处理后，分别在0h，6h，12h，24h，30h和36h采集图片，经过三次独立实验后，将各组迁移距离进行统计分析。结果如图7，图8所示，单域抗体处理后的SKOV3细胞较未处理对照组迁移变慢，表明HB-EGF单域抗体一定程度上可以抑制卵巢癌细胞SKOV3的迁移。图8是图7结果数字定量的结果，是经过三个生物学重复后统计汇总分析得到单域抗体对SKOV3细胞划痕实验迁移速率的影响折线图，表明筛选到的HB-EGF抗体能够抑制肿瘤细胞SKOV3的迁移。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明精神和原理前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体及其应用

<130> 一种肝素结合表皮生长因子的单域抗体及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln

1 5 10 15

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Ala His Tyr Thr Asp

20 25 30

Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Gly Ala Ala

35 40

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Val Ile Phe Ile Thr Tyr Asp

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Asn Thr Asn Asn Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Thr Gly Gly Trp Tyr Gly His Lys Arg Leu Asp Ser Ala His Leu

1 5 10 15

Arg Ser

<210> 8

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Val Ile Phe Ile Thr Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Thr Asn Asn Gly Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Gly Trp Tyr Gly His Lys Arg

115 120 125

Leu Asp Ser Ala His Leu Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

145 150 155 160

Asn Ser Ala Ala His Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

165 170 175

Gly Ala Ala

<210> 9

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctatgcggc ccagccggcc 60

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120

cgtctctcct gtgcagcctc cggagttatc tttatcactt acgatatggg ctgggtccgc 180

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ataccaataa cggtagcaca 240

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 300

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgact 360

gggggttggt atgggcataa gaggctggat tccgcgcact tgaggtcttg gggtcaggga 420

accctggtca ccgtctcgag cgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 480

aattcggccg cacattatac agacatagag atgaaccgac ttggaaaggg ggccgcatag 540