一种能特异结合前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术），以及基因工程抗体技术，特 别是针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体或多肽。 技术背景
[0002] 单域抗体是指由普通抗体可变区（VH或VL)组成的基因工程抗体。单域重链抗体 (又称为纳米抗体，VHH 抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chain anti body)是指仅由重链抗体(heavy-chain antibody)可变区（Variable region)组成的 基因工程抗体，其中，重链抗体(heavy-chain antibody)是一种存在于胳盤、藍鱼等动物体 内天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体是目前已知的最小的完整抗原结合片段，具有分子 量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。
[0003] 前列腺癌是一种严重威胁老年男性健康的恶性肿瘤，其早期诊断和治疗对于其预 后具有重要的意义。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA) 是一种位于前列腺细胞膜上的II型跨膜糖蛋白，由750个氨基酸组成，分为胞内区（氨基酸 序列为1-18)、跨膜区（19-43)和胞外区（44-750)，相对于传统用于临床检测的前列腺特异 抗原(prostate specific antigen，PSA)，是一种更加敏感和特异的前列腺癌肿瘤标记物， 尤其是在激素难治性前列腺癌及前列腺癌转移灶中均为高表达，在区分前列腺癌和其他类 型恶性肿瘤的敏感度和特异性分别为65.9%和94.5%。另外，在多种非前列腺来源的实体 瘤，如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和结直肠癌等，PSMA也高度特异地表达于肿瘤血管 内皮细胞上。而且本身具有神经羧基肽酶和叶酸水解酶的活性，加之707个氨基酸组成的胞 外区能够提供多个抗原表位等特点，使其成为了肿瘤免疫靶向治疗和分子影像学中重要的 研究靶点。
[0004] 目前，人们发现了多种针对PSMA亦制备了多种能与其发生特异性结合的物质，包 括单克隆抗体7E11、J591，适体A9和A10，重组技术得到的ScFv抗体D7、Fab抗体及人源化抗 体的报道，特别是已经通过美国Π )Α批准用于前列腺癌的诊断和晚期核素治疗的lllln-喷 地肽，就是基于针对PSMA的单克隆抗体与放射性核素相连而成。但与单域重链抗体相比，这 些配体存在生产成本相对较高，制备过程复杂等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，可以被用于制备 检测前列腺特异性膜抗原的试剂和工具。
[0006] 本发明提供一个针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体（即本发明一种能特异 结合前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体），具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列，其氨基 酸序列可通过标准化的抗体氨基酸序列编号方法(ImMunoGeneTics，IMGT)进行编号和结构 域的划分。
[0007] 本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含框架区中的一个或者两个以上的氨 基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有90 %同源性。
[0008] 本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含互补决定区中的一个或者两个以上 的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有80 %同源性。
[0009] 本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID N0.: 1，通过遗传密码子可以随 时获得该核酸分子的具体序列。该核酸分子的序列如SEQ ID N0. :2。
[0010] 本发明还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.: 1部分结构域，通过遗传 密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。
[0011] 本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表 达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫 细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。
[0012] 本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸 序列可以根据不同的应用目的而不同。
[0013] 本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。
[0014] 本发明还提供一种检测细胞上前列腺特异性膜抗原的方法，其特征是合有上述蛋 白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与前列腺特异性膜抗原特异性结合的能力， 建立前列腺特异性膜抗原的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片 法，亲和层析法和免疫层析法。
[0015] 本发明针对前列腺特异性膜抗原单域重链抗体在非疾病诊断治疗目的免疫检测、 以及菌体或抗原富集纯化中的应用。
[0016] 本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造， 能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于 医药、工业、农业的蛋白质或多肽。
[0017] 本发明还涉及一种针对前列腺特异性膜抗原的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭 载在载体上的配基，该材料以针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体作为配基，所述针 对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列。所述载体为 磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。
[0018] 本发明所叙述的一些术语具有如下含义：
[0019] 同源性:描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间同源性的百分比可以通过【第一个氨基酸序列中与第二个氨基酸序列中相应 位置处的氨基酸序列相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】在 乘以【100%】来计算，其中第二个氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与 第一个氨基酸相比）被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹 配的计算机运算程序如NCBI Blast获得。
[0020] 结构域:蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT编号：IMGT数据库（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一种 已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（E h r e n m a η，F ·， Q.Kaas，et al.(2010).''IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies ?T cell receptors，MHC， IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res38(Database issue):D301_307.Lefranc，M.P·， C.Pommie，et al · (2003) ·''IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains"Dev comp Immunol 27(1) :55-77.http://www. imgt.org/)中的描述。
[0022] 密码子(codon):又称为三连体密码子(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核 苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
[0023] 本发明的有益效果:本发明针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体或多肽具有 与前列腺特异性膜抗原特异性结合、可以通过生物学方法大规模生产、成本低、高效、分子 量小、渗透性好等性质，显示出良好的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1菌落PCR产物电泳、重组蛋白电泳和Western Blot鉴定图。左边Marker泳道为 DNA分子量标准，泳道1中的菌落PCR片段出现在预期位置。中间为纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，在预期位置出现明亮条带。右边为以抗PSMA单克隆抗体和抗His标签抗体的 Western Blot鉴定图。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这些 具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
[0026] 实施例1
[0027] 前列腺特异性膜抗原膜外区的真核表达
[0028] 采用RNAiso Plus试剂提取高表达PSMA的LNCaP细胞中总RNA，利用RT-PCR方法得 到编码PSMA胞外区片段的DNA片段，使用Not I与BamH I两种限制性内切酶将其插入真核表 达载体pRAG2a，通过T4DNA连接酶连接为重组质粒。重组质粒热击转化到T0P10感受态细胞 培养过夜，将鉴定正确的克隆送测序验证。提取阳性克隆的质粒，使用脂质体 Lipofectamine 2000将DNA质粒转染至HEK-293细胞中培养，于不同时相点收集上清，进行 SDS-PAGE电泳检测。培养一定时间后，按照HisTrap FF Crude试剂盒操作纯化该蛋白。将纯 化后的蛋白进行SDS-PAGE后，电转至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭后，分别加入PSMA抗体和 His抗体，4°C过夜;漂洗后，加二抗室温下孵育lh，再次漂洗，加入显色液进行显影(图1)。 [0029] 实施例2
[0030]抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体（即针对抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗 体)的淘选与鉴定
[0031]采用固相淘选的方法从驼源天然抗体噬菌体展示文库(为参考文献:〃涂追，许杨， 刘夏，等.驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31 (4): 31 -36."中构建的展示文库）中淘选针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体。前列腺特异性 膜抗原膜外区的表达按照上述的实施例1进行，第一轮淘选时，采用磷酸盐缓冲溶液(PBS， pH7.4)稀释上述合成的PSMA胞外区蛋白至150yg/mL (第2-4轮包被浓度分别为100、50、50μ g/mL)，在酶标板上每孔加入100yL，4°C包被过夜。PBST (含0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37°C封闭2h，洗板3次，加入与0.5%BSA-PBS孵育过的噬菌体抗体库100yL(约含2 X10nCFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐轮增加3次），再用PBS洗板10次(逐轮增加5次）。 再以100yL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH 2.2)洗脱吸附的噬菌体(37°C，5min)，用50yLTris-HCl (lmol/L，pH 9.0)中和洗脱物，取10yL用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。 [0032]经过四轮淘选后采用浓度为5yg/mL的PSMA胞外区蛋白包被酶标板，洗板、封闭同 上。加入扩增纯化的噬菌体克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀释度 为1: 5000的HRP-anti-M13抗体，lOOyL/孔，37°C孵育 lh JBST洗板5次，加 TMB工作液lOOyL/ 孔，室温20min，每孔加入50yL硫酸(浓度为2mol/L)终止反应，测定450nm吸光值。以前一轮 扩增的噬菌体抗体库直接包被酶标板作为阳性对照，以PBS替代噬菌体克隆为空白对照，用 间接phage-EL ISA法测定菌体颗粒的结合活