一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗菌肽及其应用，特别涉及一种蝇蛆抗菌肽、表达抗菌肽的食品 级重组乳酸菌及其制备抗菌添加剂中的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 抗菌肽(antibacterial peptides)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体 感染的多肽，它除具有非特异性的抵抗细菌、真菌、病毒等病原体外，还有抗肿瘤细胞的作 用，特别对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，而不破坏人体的正常细胞，是一类具有巨大 发展潜力的新型抗菌药。抗菌肽这类活性多肽具有免疫原性小、热稳定性好、水溶性好、抗 菌谱广等优点。已有研究表明，在动物日粮中添加抗菌肽能够提高动物的生产性能和饲料 利用率、改善动物肠道微生态环境、促进动物的细胞和体液免疫应答，提高动物的免疫机能 与抗病力。此外，在饲料中添加抗菌肽，可以取代抗生素，消除抗生素的过度使用导致致病 菌产生耐药性和农产品抗生素残留的问题。
[0003] 蝇及幼虫蛆主要生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表 带有许多病原菌，能传播多种疾病，但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇 应该对病原微生物有强大的免疫力，并能产生强效抗菌物质。这种物质就是蝇蛆抗菌肽。 [0004]蝇蛆抗菌肽是蝇蛆经过病原菌诱导后而产生的一系列具有抗菌活性的弱酸性多 肽物质，热稳定高，其分子量通常在5-10kDa。蝇蛆抗菌肽不仅具有杀灭细菌的功能，还具有 抵抗真菌等微生物的功能，甚至病毒、真菌、藻类、原虫及寄生虫，甚至肿瘤等都具有抑制或 杀灭作用。
[0005] 蝇蛆抗菌肽是一系列多种抗菌肽的混合物，单独纯化其中一种抗菌肽极其困难。 目前其生产和提取主要依赖天然蝇蛆中提取总抗菌肽，产率低，而且抗菌活性不稳定。同时 由于蝇蛆生长环境含有大量病原细菌，因此抗菌肽提取生产过程要严格注意卫生防护，否 则产品用于饲料添加用途容易造成病害传播和扩散。蝇蛆抗菌肽距离规模化生产，还有较 长的技术差距。
[0006] 肠道病原菌是家畜和家禽养殖业造成死亡的主要原因之一。养殖业对抗生素的长 期使用，造成耐药菌的泛滥。据统计，从猪肠道分离的56株肠道病原菌，85%的菌株对诺氟 沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林和头孢噻吩均有耐药性。抗生素过度使用还造成水产品 中抗生素残留量过高的严重问题，对消费者的健康造成严重威胁。土霉素，氯霉素等常见水 产用抗生素在市售鱼虾蟹类产品中屡有检出，甚至出口产品也屡遭检出。
[0007] 抗菌肽作为饲料添加剂，可以完全替代抗生素的使用，而且抗菌范围广，无耐药性 和抗生素残留的问题。但是抗菌肽的天然来源匮乏和提取成本过高是限制其使用的主要障 碍。
[0008] 采用基因工程技术，利用微生物细胞工厂，导入抗菌肽基因，获得重组表达抗菌肽 的工程菌。利用工业化发酵技术，规模化生产重组抗菌肽是可行的技术路线。很多重组药物 蛋白使用大肠杆菌，毕赤酵母，芽孢杆菌表达系统已经实现了规模化生产。
[0009]乳酸菌是美国FDA认证的可用于食品生产的安全微生物，常见用途之一为饲料添 加的益生菌剂，具有改善肠道微生态体系，维持肠道平衡和机能，提高宿主免疫力的功效。 乳酸菌是宿主肠道天然共生菌，能够在消化道内黏附和定植，长期发挥益生作用。利用乳酸 菌作为宿主，表达重组蝇蛆抗菌肽，抗菌肽分泌或者展示于重组乳酸菌的细胞壁表面。重组 活性乳酸菌作为益生菌添加入饲料，饲喂动物。重组乳酸菌在宿主肠道内定殖，不断分泌抗 菌肽，杀灭肠道病原菌，促进宿主免疫应答，兼具发挥抗菌和益生菌功效，具有巨大应用潜 力。
[0010]乳酸菌重组表达载体是乳酸菌应用中的关键技术之一，但是作为穿梭载体，很多 都带有抗生素抗性基因作为筛选标记，这些抗性基因如果跟随菌体进入宿主，可能会以基 因水平转移的方式进入宿主肠道菌群传播，加速菌群的抗药性发展。开发一种不含抗生素 标记的乳酸菌表达载体是其在食品，医药领域拓展应用的前提。
[0011] 相对于胞内表达，工程菌细胞壁表面展示和分泌表达重组蛋白，更有利于蛋白的 释放和发挥效用。而且展示在细胞壁表面的蛋白比游离的蛋白稳定性更好，能够在宿主体 内长期发挥效用。
[0012] 乳酸菌表达和展示表达外源抗原蛋白，在活菌疫苗产品领域屡有应用，取得了不 错的效果。但是乳酸菌作为表达外源抗菌肽的细胞工厂，特别是在细胞壁表面展示，却至今 是研究的空白领域。
[0013] 近年来，随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，以活体乳 酸菌为递送载体的药物递送逐渐成为乳酸菌应用研究的一个热点。乳酸菌是一个十分良好 递送载体，因为它是益生菌，适应肠道环境，更重要的是，它的定殖位点是小肠内壁的上皮 细胞，能够竞争许多病毒的空间位点，从而起到抗病毒的作用。同时，乳酸菌本身又是天然 的免疫佐剂，能够分泌多糖，对人体有良好的免疫促进作用。
[0014] 使用食品级乳酸菌开发蝇蛆抗菌肽还具有如下优势：
[0015] 重组抗菌肽可以活菌形式使用，无需纯化，成本低廉，易于大量生产。乳酸菌本身 就能产生细菌素等抗菌物质，可以起到与蝇蛆抗菌肽联合抗菌的作用。
[0016] 国内专利（公开号CN103908668A)公布了具有免疫佐剂作用的蝇蛆抗菌肽及其制 备方法和含该抗菌肽佐剂的疫苗制剂，以及它们在制备疫苗制剂中的应用。该专利与直接 提取抗菌肽有关，没有用到重组抗菌肽的技术手段。
[0017] 乳酸菌活载体已经广泛应用于黏膜免疫的疫苗开发。
[0018] 欧盟专利(EP1066375B1)公布了一种罗伊氏乳杆菌细胞壁表面展示抗原的方法， 美国专利live(US2009/0324638Al)公布了一种用于乳酸菌分泌或者细胞壁展示蛋白质或 者多肽的方法。但是都没有关于蝇蛆抗菌肽在乳酸菌中表达或者展示的专利公布。
[0019] 截至目前，还没有一种食品级乳酸菌重组表达蝇蛆抗菌肽的整体解决方案。 (三)
【发明内容】
[0020] 本发明目的是提供一种食品级表达蝇蛆抗菌肽重组乳酸菌及其应用，即提供一种 蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其作为抗菌剂的应用。
[0021] 本发明采用的技术方案是：
[0022]本发明提供一种蝇蛆抗菌肽，所述蝇蛆抗菌肽氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0023] 本发明还提供一种所述蝇蛆抗菌肽编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0024] 本发明涉及一种由所述蝇蛆抗菌肽编码基因构建的重组载体。
[0025]本发明还涉及一种由所述重组载体转化制备的食品级重组基因工程菌。
[0026] 此外，本发明还提供一种所述蝇蛆抗菌肽编码基因在制备抗菌肽中的应用，所述 的应用为:将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组载体转化至乳酸菌中，接种至MRS培养基，30°C 培养48小时，当菌体0D6QQnm大于20且pH值低于4时反应结束，将培养液在4°C、6000rpm离心 30min，收集菌体，即获得含蝇蛆抗菌肽的菌体细胞。
[0027] 本发明还涉及一种所述蝇蛆抗菌肽在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂为革兰氏 阳性菌或革兰氏阴性菌的抗菌剂，优选所述革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球 菌或蜡状芽孢杆菌，革兰氏阴性菌为李氏杆菌或大肠杆菌。所述抗菌剂是将含蝇蛆抗菌肽 编码基因的重组基因工程菌(优选重组乳酸菌)经发酵培养获得的培养物，所述抗菌剂的用 量为100毫升菌液（1〇 7~109CFU/mL)每公斤饲料。具体所述抗菌剂按如下方法制备:将含蝇 蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌(优选重组乳酸菌)接种MRS培养基，30°C培养48小时， 检测菌体密度和培养体系pH值，菌体0D 6QQnm大于20且pH值低于4即可认为发酵结束，4°C、 6000rpm离心30min，收集菌体，即为抑菌剂，使用时可以将菌体用等体积灭菌roS缓冲液悬 浮菌体制备菌悬液。
[0028] 本发明所述含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌按如下方法获得：（1)抗菌 肽表达框为：LDH启动子（SEQIDN0.4)-信号肽（SEQIDN0.5)-锚定蛋白（SEQIDN0.6)-蝇蛆抗菌肽（SEQ ID N0.3);
[0029] (2)alr基因（丙氨酸消旋酶)表达框：以植物乳杆菌基因组DNA为模板，使用引物 alrF(SEQIDN0.10)和alrR(SEQIDN0.11)，PCR扩增，获得alr(丙氨酸消旋酶）基因 （SEQ IDN0·9)，将PGADPH基因片段（SEQIDN0·8)和alr的PCR扩增产物（SEQIDN0·9)为模板，加 入引物PGADPHF(SEQIDN0·12)和alrR(SEQIDN0·ll)，将启动子P GADPH与alr基因融合，构建 air基因表达框。
[0030] (3)alr基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳酸乳球菌株:将DNA片段： alr基因上游500bp同源臂（SEQIDN0.17)-lox位点序列（SEQIDN0.13)-氯霉素抗性基因 表达框（SEQ ID N0.16)-lox位点序列（SEQ ID N0.15)-alr基因下游500bp同源臂（SEQ ID NO. 18)电击转化至乳酸乳球菌株，筛选air基因（丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳 酸乳球菌株。
[0031] 本发明由所述蝇蛆抗菌肽编码基因构建的重组载体是通过IDH启动子，USp45信号 肽和GSA锚定子的组合使用构建重组载体，再将重组载体转化至乳酸菌中，获得的重组基因 工程菌使抗菌肽被分泌表达到细胞外，或者展示在细胞壁的表面。表达载体不携带外源性 抗生素，通过载体自带的丙氨酸消旋酶，在不添加 D-丙氨酸的MRS培养基中培养，筛选阳性 克隆。