重组聚多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及可以筛选构建各种长度的重组聚多肽和包含该重组聚多肽的药物组 合物。
【背景技术】
[0002] 生物活性大分子，一般是不稳定的多肽或者蛋白质，大部分半衰期都较短，为了维 持一定的疗效需要大剂量频繁给药，长期的反复注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一 系列副反应。另外，许多生物活性肽和蛋白质只具有有限的溶解度，或者在重组生产过程中 易聚集，需要复杂的溶解和重折叠过程。多种化学聚合物可以连接到这些蛋白质上以改变 其性质。特别有意义的是具有柔性构象并且在水溶液中良好水合的亲水性聚合物。一种常 用的聚合物是聚乙二醇(PEG)，目前已用于多种蛋白质药物或非蛋白质药物的修饰，在国外 已经上市的PEG化药物已达11种，并且国内外有多种PEG化药物在研或者已经进入临床。这 些聚合物常常具有依赖于它们分子量的较大的流体动力学半径，并且会显著增强药代动力 学性质。但PEG修饰蛋白质类药物需要额外的下游工艺和纯化步骤，从而会降低产量、增加 成本;并且，常用的PEG化修饰位点是赖氨酸和蛋白质的N-端氨基酸残基，这种随机性的修 饰方式会形成多种结构，影响PEG修饰后的蛋白质纯化，这种不均一性也会影响修饰后的蛋 白质活性，因此需要开发PEG的定点修饰技术；同时现在大量临床实验发现反复长期给予 PEG化的药用蛋白后，可能会形成抗PEG的抗体介导机体对药用蛋白的清除；在动物实验中 发现PEG还可能在组织中蓄积，严重时可对肾脏造成损伤。
[0003] 白蛋白和免疫球蛋白片段如Fc区也已经用于偶联其它生物活性蛋白质，但在半衰 期或免疫原性提高方面具有不可预测的结果。遗憾的是，Fc融合或者白蛋白融合都需要在 真核重组表达系统中进行。这是一个耗时的、昂贵的过程。因此，仍然非常需要能够提高生 物活性多肽或蛋白质安全性和药学性质的聚合物和方法。
[0004] 近年来研究，为了解决PEG修饰的问题，开发了模拟PEG的聚多肽融合技术。模拟 PEG的聚多肽融合技术经过了多年的发展，从一开始的天然来源的聚多肽、明胶样蛋白聚多 肽、弹性蛋白样聚多肽、多聚谷氨酸、多聚甘氨酸到现在的最新的XTEN技术（如专利 102348715A记载）。聚多肽XTEN技术已经可以解决原有聚多肽免疫原性高、易聚集、不能显 著增加半衰期等问题。目前，聚多肽融合技术虽还在发展的初期，但XTEN修饰的长效rhGH已 经进入了临床Phase II期，XTEN修饰的Exendin-4也进入临床Phase I期，我们相信聚多肽 技术将会为多肽和蛋白质类药物长效化提供更好的选择。现有模拟PEG的聚多肽融合技术 具有以下诸多优点：1.通过基因工程技术构建，可与药用蛋白融合表达，避免了体外PEG化 学偶联和修饰后的纯化步骤;2.区别于PEG修饰技术融合表达的聚多肽链是完全可生物降 解的；3 .动物实验结果表明，这些PEG模拟肽都是安全和低免疫原性的；4.多肽链有确切的 长度和氨基酸组成，可通过调节多肽链长度，调节融合蛋白的半衰期；5.适用范围广泛，原 核、真核系统都可以表达。与PEG修饰相比，聚多肽在下游纯化、免疫原性、安全性等方面都 具有明显的优势。但新型聚多肽XTEN融合技术并没有完全模拟PEG。XTEN带有显著的负电荷 (Schellenberger，Volker，et al .Nature biotechnology27.12(2009): 1186-1190.)，区别 与传统的PEG修饰技术，显著负电荷存在着一些缺点：1.影响药物的组织分布;2.减低与革巴 受体的亲和力，降低生物活性;并且XTEN基本是由非重复基序组成，筛选过程复杂且庞大。 因此，仍然需要建立筛选过程相对简单的模拟PEG的聚多肽分子用于提高生物活性蛋白质 的药用性质。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及能够用于提高生物活性蛋白质的生物学、药学、安全性和治疗性质的 组合物和方法。该组合物和方法可用于提高药代动力学性质，如半衰期，延长生物活性蛋白 质治疗窗内停留的时间，以及简化这种生物活性蛋白质的生产过程和药学性质，如溶解性。
[0006] 部分上，本发明涉及包含融合蛋白的药物组合物及其在治疗疾病、障碍或病症中 的应用。可以治疗的具体的疾病取决于生物活性蛋白质的选择。
[0007] 本发明提供聚多肽的组合物，当重组聚多肽连接到生物活性蛋白质时提高药代动 力学性质，和/或治疗活性。这样的组合物可以用于治疗某些疾病、障碍或病症。得到的融合 蛋白可以表现出更好的安全性性质，并且允许频率较低的给药，这又导致了更好的患者依 从性。本发明也提供了编码聚多肽与聚多肽连接的生物活性蛋白质的融合蛋白的多聚核苷 酸序列。
[0008] 本发明提供分离的聚多肽，其包含超过大约100至大约5000个氨基酸残基，其中该 聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K) 六种氨基酸残基的总和占聚多肽总氨基酸序列的超过大约95%以上;聚多肽序列是可重复 的;通过G0R算法确定，该聚多肽序列至少具有95 %的无规则卷曲形成;通过Chou-Fasman算 法确定，该聚多肽序列具有α螺旋和β折叠的总和小于2%。
[0009] 作为优化方案，本发明提供包含超过大约100至大约5000个氨基酸残基的聚多肽， 其中该聚多肽的特征在于由短序列组成，重复的短序列可以占到总序列大约30%以上，其 中每个短序列具有大约8至24个氨基酸残基，其中任意一种氨基酸在序列中都不会连续出 现，该序列由甘氨酸(G)、丙氨酸(Α)、丝氨酸(S)、苏氨酸(Τ)、脯氨酸(Ρ)和赖氨酸(Κ)中的3-6种类型的氨基酸组成。该聚多肽当连接到生物活性蛋白质时增强生物活性蛋白质的药代 动力学性质，其中药代动力学性质通过测定施用于受试者的生物活性蛋白质的血浆半衰期 与连接到生物活性蛋白质并以相当的剂量施用于受试者的聚多肽融合蛋白来确定。
[0010] 在上述实施方案的一些情况中，没有一种类型的氨基酸占聚多肽序列的50%以 上，没有任何一种类型的氨基酸会连续出现。
[0011] 在一些情况中，分离的具有上述实施方案的聚多肽的融合蛋白包括胰岛素、胰岛 血糖素样肽-1、胰高血糖素、蜥外泌肽-4、生长激素、促卵泡激素、甲状腺激素、降钙素、促红 细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子-1、干扰素_α、干扰素_β、干扰素-γ、 人成纤维细胞因子-21、白介素-IRa、白介素-2、凝血因子Vila、天冬酰胺酶、凝血因子VIII、 凝血因子IX及其他蛋白类或多肽药物。
[0012] 在一些实施方案中，所得融合蛋白的增强的药代动力学性质包括血浆半衰期提高 至至少5倍。
[0013] 在一个实施方案中，分离的融合蛋白与未连接到聚多肽的生物活性蛋白质相比可 以具有较低的免疫原性，其中通过在给受试者施用相当剂量后测定选择性结合生物活性蛋 白质的IgG抗体的产生确定免疫原性。
[0014] 在一个实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，与聚多肽进行融合的蛋白 其表现出与表24的序列至少大约90 %的序列同一性。其中聚多肽包含超过大约100至大约 5000个氨基酸残基，其中该聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸（S)、苏氨酸 (T)、脯氨酸（P)和赖氨酸(K)六种氨基酸残基的总和占聚多肽总氨基酸序列的超过大约 95%以上;通过G0R算法确定，该聚多肽序列至少具有95 %的无规则卷曲形成;通过Chou-Fa s ma η算法确定，该聚多肽序列具有α螺旋和β折叠的总和小于2 %。
[0015] 在一个实施方案中，本发明提供的分离的融合蛋白与含有大量谷氨酸残基的带有 显著负电荷的聚多肽的融合蛋白相比，具有较高的对相应靶受体的结合亲和力。在一个实 施方案中，该聚多肽融合蛋白表现出与靶受体的结合，其范围为带有负电荷的聚多肽的融 合蛋白的相应靶受体的结合能力的大约120%_150%。
[0016] 其中，与该聚多肽进行融合的蛋白可以设计为具有不同的融合方式，可以在生物 活性蛋白质的Ν端或者C端融合，可以根据不同的需求，选择不同的融合位置。
[0017] 其中，与该聚多肽进行融合的蛋白可以融合不止一个的生物活性蛋白质；融合蛋 白中也可以含有不止一个聚多肽序列。
[0018] 本发明提供分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：（a)编码上述任一实施 方案的融合蛋白的多核苷酸及其多核苷酸的互补序列；（b)上述表达的任一表达载体进一 步包含连接到多核苷酸序列的重组调节序列。
[0019] -种改善生物活性蛋白质的性质的方法，包括将生物活性蛋白质连接到该聚多肽 以实现一种性质的步骤，该性质的特征在于：（a)连接到聚多肽的生物活性蛋白质的血浆半 衰期比未连接到聚多肽的生物活性蛋白质的血浆半衰期长；（b)因聚多肽本身完全不带电 荷的性质，连接到聚多肽的生物活性蛋白质与未连接到聚多肽的生物活性蛋白质相比，生 物活性并未有显著改变；（c)连接到聚多肽的生物活性蛋白质在生理条件下的溶解度比未 连接到聚多肽的生物活性蛋白质的溶解度提高；（d)当施用于受试者时选择性结合连接到 聚多肽的生物活性蛋白质的IgG抗体的产生比当以相当的剂量向受试者施用未连接到聚多 肽的生物活性蛋白质时IgG的产生减少；（e)连接到聚多肽的生物活性蛋白质当比未连接到 聚多肽的生物活性蛋白质施用于受试者时只需要更低的给药频率。
[0020] 有益效果
[0021] 1.本发明首次利用建库筛选的方法得到稳定的、无结构的、低免疫原性的由甘氨 酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和赖氨酸中的3-6种类型的氨基酸构成的各种长度的聚 多肽，并且因为聚多肽序列是可重复的，相较于基本非重复序列可以利用构建的筛选系统 进行快速的筛选，即降低了筛选工作量又保证了聚多肽优越的性质。
[0022] 2.本发明构建的聚多肽模拟PEG修饰技术，可以通过显著的增加流体动力学体积 从而显著延长半衰期，此新型聚多肽随着序列长度的增加，融合蛋白的半衰期会出现高于 比例的延长;并且该聚多肽克服了原有带显著负电荷聚多肽易降低与靶受体亲和力的缺 点。
[0023] 3.本发明构建并表达了多种聚多肽与生物活性蛋白质的融合蛋白，具有增强稳定 性、延长半衰期、降低免疫原性、不改变生物活性等诸多优点，其有望成为生物活性分子的 新型改造策略。
【附图说明】
[0024]本发明的特征和优点可以参考以下详细说明和阐述说明性实施方案的附图进一 步解释。
[0025]图1显示聚多肽融合蛋白的原理示意图。FGF21为示意分子，聚多肽可以和任意多 肽或蛋白质药物融合表达。图中显示的表达载体，可以为真核表达载体或者为原核表达载 体。聚多肽可以连接在生物活性大分子药物的N端或者C端，这取决于生物活性分子的活性 中心而定。图中的聚多肽长度可以为多种长度，长度可按照对于融合蛋白的半衰期的要求 而定。
[0026] 图2是聚多肽基因的示例性多核苷酸构建体的示意图。各氨基酸序列（如9氨基酸 或10氨基酸序列)通过自连接反应连接得到更长的序列，将聚多肽插入GFP筛选载体的BspQ I位点。BspQ I位点始终位于插入片段的5'端，可根据需求不断插入序列，从而达到我们需 要的长度，进行筛选。
[0027] 图3是聚多肽装配、生产和评价的典型步骤的示意流程图。短序列文库的装配是随 机的过程，必然会出现短序列的连续重复出现，因此聚多肽序列中短序列是可重复的，并且 会有一定的比值。
[0028] 图4是改造的筛选质粒DMT-GFP示意图及酶切鉴定图。图B中显示一种筛选载体，来 自于多点突变pET28a( + )载体而得。通过单酶切鉴定，该载体只含有一个BspQ I位点。图A琼 脂糖核酸电泳中1泳道为pET28a-GFP质粒，2泳道为pET28a-GFP质粒BspQ I单酶切，3泳道为 DMT-GFP质粒，4泳道为DMT-GFP质粒BspQ I单酶切。
[0029] 图5是短序列自连接反应琼脂糖电泳图。
[0030] 图6显示包含GFP和聚多肽序列的所示构建图的表达实验的结果。使用