5]以PT04为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列。其1000个氨基酸序列具 有[X]100,其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段， 将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT20。我们 从PT20文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧 光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体 的区段在表20中列出。
[0116] 表20:P1000区段的氨基酸序列
[0118] 以PT05为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列。其1000个氨基酸序列具 有[X]50,其中X是含有20个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将 连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT21。我们从 PT21文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光 的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的 区段在表21中列出。
[0119] 表21:P1000区段的氨基酸序列
[0121] 实施例6:聚多肽的可重复性分析
[0122] 可以通过定量相同单元短序列连续在一条聚多肽链中的出现数之和来定义聚多 肽的可重复性:将相同单元的连续出现数之和相加除以构成该聚多肽的总的单元数减去 一。如完全由同一个10个氨基酸短序列为一个单元的构成一条长1000个氨基酸残基的聚多 肽，该条聚多肽的相同单元的连续出现数为99,除以总单元数减去一，其可重复性为100%; 如构成一条长1000个氨基酸残基的聚多肽完全由100条不同的10个氨基酸的短序列构成， 该条聚多肽的可重复性为0%。得到的重复性比例反映了该聚多肽内的重复性的程度。表22 中列出实施例1-5中所有举例序列的重复性程度。结果表明含有100-5000个氨基酸的聚多 肽的总序列是可重复的，并且重复程度都大于30%，甚至可以达到100%。
[0123] 表22:聚多肽序列的重复性分析
[0124]
[0126] 实施例7 :聚多肽的可重复与非重复的对比研究
[0127] 为了研究聚多肽中短序列重复性的意义，我们在库PT04的基础上增加库的容量， 进行与实施例2-4所描述的相似的筛选步骤，将经过自连接反应所得的[X]100,其中X是 PT04库中10个氨基酸短序列，筛选得到100个含有10个氨基酸短序列连接而成的1000个氨 基酸的聚多肽，挑选1000株全部进行核酸测序鉴定，从中挑选出一株完全非重复的聚多肽。 并与PT20文库中筛选出的一株完全连续重复的序列进行理化性质比较，通过G0R算法确定， 这两条聚多肽都至少具有95%的无规则蜷曲形成;通过Chou-Fasman算法，这两条聚多肽的 α螺旋和β折叠的总和都小于2%。并且本领域中已经建立了多种方法用来判定多肽的二级 结构，其中通过圆二色谱法测定这两种聚多肽，如图10所示，这两种聚多肽的二级结构均无 显著差异，都是在198nm处有显著负峰，说明这两种聚多肽都有极高比例的无规则卷曲的存 在。因此这两种聚多肽在生理条件下都是缺乏二级结构的。因此完全连续重复的聚多肽并 没有出现聚集形成更高级结构的倾向。并且对于重复性比较高的聚多肽来说其在筛选工艺 上的简单快捷使其比基本非重复的聚多肽拥有更大的优势。
[0128] 表23:可重复聚多肽与非重复聚多肽的对比
[0130] 实施例8:将该聚多肽应用于多种蛋白质分子
[0131] 本发明的一个方面是向多种蛋白质分子中引入该聚多肽，从而产生用于治疗多种 疾病或病症的组合物。表24提供了部分本发明的聚多肽融合蛋白（胰岛素，胰岛血糖素样 肽-1，胰高血糖素，蜥外泌肽-4，生长激素，促卵泡激素，甲状腺激素，降钙素，促红细胞生成 素，粒细胞集落刺激因子，胰岛素样生长因子-1，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，人成纤维 细胞因子-21，白介素-IRa，白介素-2,凝血因子Vila、凝血因子VIII、凝血因子IX或天冬酰 胺酶），选择融合的蛋白或多肽的序列。本发明的选择与聚多肽融合的蛋白质可以是显示与 选自表24的蛋白质或多妝序列有至少80%以上的序列一致性。
[0132] 表24:本发明中用于融合的蛋白质的氨基酸序列
[0135] 实施例9:产生和评价聚多肽的方法，以聚多肽融合的FGF21为例
[0136] 用于生产和评价聚多肽组合物的示意图在图1中显示，并且构成了本实施例的一 般性说明的基础。使用公开的方法和本领域普通技术人员已经的方法，结合说明性实施例 提供的指导，本领域技术人员能够产生和评价一定范围的包换PsTag的融合蛋白因此本实 施例被解释为只是说明性的，并非以任何方式限制所述方法，许多变化对于本领域技术人 员是明显的。在本实施例中，将聚多肽连接到人成纤维细胞生长因子-21(FGF21)。
[0137] 图2、图3是本发明一个实施方案的聚多肽的多聚核苷酸构建体装配的代表性步骤 的示意流程图。图2中各个短寡核苷酸(如PT01中10氨基酸序列或PT06中9氨基酸序列）退火 成双链DNA片段，它们可通过自连接反应得到多聚化产物，例如通过10个氨基酸序列两连接 得到20个氨基酸的区段。编码PsTag序列的基因可以通过连接20个氨基酸的区段得到我们 希望的长度来装配，如图1所描述的示意图，最终得到的是长度为600个氨基酸残基，同时通 过这种方法可以达到更长的长度。
[0138] 在图7所示的实施例中，可以在载体中插入P200，P400，P600序列，其后为FGF21序 列，该填充序列两端为EcoR I和Hindlll，在此情况中该基因编码N至C末端结构为P-FGF21 的融合蛋白。
[0139] 编码人FGF21的DNA序列可以通过本领域已知的标准方法从由适当细胞来源、由基 因组文库制备的cDNA文库方便地获得，或者可以使用从公开数据库、专利或参考文献中获 得的DNA序列合成产生。编码该蛋白质的FGF21的部分基因或多核苷酸后可以克隆构建体如 本文所述的构建体内，该构建体可以是在适当转录和翻译序列控制下的质粒或其它载体， 用于在生物系统中高水平蛋白质表达。并且该构建体可以设计为不同的结构，以编码融合 蛋白的各种排列。例如，可以产生编码以下顺序的融合蛋白的基因(N-到C-末端）:P-FGF21， FGF21-P，FGF21-P-FGF21，P-FGF21-P等。任选地，该嵌合DNA分子可以转移或克隆到作为更 合适的表达载体的另一构建体中。在这点上，能够表达该嵌合DNA分子的宿主细胞将用该嵌 合DNA分子转化。含有目标DNA区段的载体可以通过众所周知的方法将转移到合适的宿主细 胞中，这取决于细胞宿主的类型，如上文所述。
[0140] 含有P-FGF21表达载体的宿主细胞在常规LB培养基中培养。培养条件如温度、pH等 是以前用于为表达选择的宿主细胞的条件，对于本领域技术人员来说是明显的。在融合蛋 白表达后，通过离心收集细胞，通过物理或化学手段破碎，保留得到的粗提物用于如以下所 述纯化融合蛋白。P-FGF21产物通过本领域已知的方法纯化。诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分 级分离、离子交换层析、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法或凝胶电泳等操作都是可以 在纯化中使用的技术。然后，我们使用本领域已知的方法表征分离的融合蛋白的序列、纯 度、表观分子量、溶解度和稳定性。最后评价满足预期标准的融合蛋白的活性，这可以使用 一种或多种本文提到的在体外或体内的检测手段。
[0141] 实施例10:聚多肽的稳定性
[0142] 含有融合到FGF21的N端P600的融合蛋白在小鼠血清和小鼠肾匀浆中进行稳定性 实验。在小鼠血清中37°C孵育，分别在Oh，lh，3h，6h，18h，24h，48h取样，并通过SDS-PAGE分 析，然后使用Western Blotting分析并使用抗FGF21抗体检测，如图8所示。P600-FGF21融合 蛋白在血浆中48h才开始显示出有降解的迹象。在小鼠肾均浆中37°C孵育lh，分别使用不稀 释的肾匀浆、稀释比为1: 5、1:10、1: 50、1: 100、1:1000,并通过SDS-PAGE分析，然后用 Western Blotting分析并使用抗FGF21抗体检测。如图9所示，P600-FGF21在肾匀浆中快速 降解。这些结果证明了 P600-FGF21对血清蛋白酶引起的的降解有抗性，这是聚多肽融合蛋 白增强药代动力学性质的一个因素。而P600-FG21能在肾匀浆中迅速降解也说明了聚多肽 分子显著区别于PEG分子的特性，可以克服PEG分子在肾细胞中不易被降解从而易引起肾空 泡现象的问题。
[0143] 实施例11:聚多肽的理化性质
[0144] 含有融合到FGF21的N端P200、P400、P600以及原型FGF21进行圆二色谱实验，鉴定 其蛋白质二级结构。在PBS缓冲体系中扫描CD紫外区段190-240nm。如图11所示，融合了聚多 肽后在198nm处有显著负峰，并且随着聚多肽链的增长，198nm处的负值显著增加，表明无规 卷曲程度也逐渐增加。含有融合到FGF21的N端的P600进行等电聚焦电泳，鉴定融合蛋白的 等电点。如图12所示，P600-FGF21的等电点在5.3左右，如原型?6?21等电点相似，可以说明 组成聚多肽的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)因为其自身不带电 荷的性质，与蛋白融合并不会改变其等电点。
[0145] 实施例12:聚多肽融合FGF21在小鼠中的药代动力学
[0146] 在小鼠中检测原型人FGF21、P200-FGF21、P400-FGF21、P600-FGF21的药代动力学。 在注射后的不同时间分析血液样品，通过ELI SA测定血清中FGF21的浓度，其中使用抗FGF21 抗体用于捕获，结果总结在图13中。它们显示随着聚多肽序列长度增加，半衰期惊人的增 加。例如，确定原型人FGF21只具有0.34h，对于融合了该聚多肽的分子，当聚多肽长度达到 200个氨基酸时，半衰期达到5.67h。聚多肽长度从200到400个残基增加了 200个残基使半衰 期增加到8.8h。并且，聚多肽长度从400到600个残基增加了 200个氨基酸残基使半衰期延长 达到12.93h。这些结果显示聚多肽长度具有惊人的阈值，它导致体内半衰期高于比例的延 长。因此，预期任何融合了聚多肽的蛋白具有与更长的药代动力学性质。
[0147] 表25:包含FGF21和聚多肽组合物的药代动力学参数
[0148]
[0149 ]实施例13:聚多肽与多种蛋白融合后的在小鼠体内的半衰期研究
[0150] 采用与实施例12中描述相同的方法，结果发现融合了聚多肽的蛋白质或多肽的血 浆半衰期都有显著性提高。相比于未融合前的蛋白半衰期至少提高5倍。
[0151] 表26:聚多肽与多种蛋白质融合前后的半衰期对比
[0154] 实施例14:聚多肽在小鼠中免疫原性分析
[0155] 在小鼠中检测P600-FGF21和FGF21在小鼠中的免疫原性，一共给药8次，隔天给药， 第一次加弗氏完全佐剂，后七次加弗氏不完全佐剂。给药完一周后开始使用ELISA的方法检 测小鼠血清，血清中抗FGF21的抗体含量如图14所示。融合了聚多肽的FGF21在小鼠体内免 疫原性明显下降。不加佐剂组的P600-FGF21并没有检测到抗体。这些结果都表明了聚多肽 分子在小鼠体内可以显著降低免疫原性。
[0156] 实施例15:通过连接到聚多肽可以提高FGF21的溶解度和稳定性
[0157] 为了评价聚多肽增加溶解度和稳定性的物理化学性质，制备了P600-FG21，在中性 pH的Tris-缓冲液中制备测试物，P600-FGF21溶液的表征通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法 进行，以证实该蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。另外，评价了P600-FGF21的稳定性，发 现在液体制剂