一种分离提纯必特螺旋霉素的工艺方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离提纯必特螺旋霉素的工艺方法，属于抗生素分离提纯技术领域。
【背景技术】
[0002]大环内酯类抗生素(Macrolides antib1tics)是应用最为广泛的抗菌药物之一，分子结构母体是14?16元环大环内酯，内酯环上的羟基通过糖苷键与I?3分子的糖或氨基糖相连。迄今为止发现的该类抗生素达100余种，临床上常用的有:14元环红霉素(Erythromycin)及其衍生物罗红霉素(Roxithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)，15元环红霉素衍生物阿奇霉素(Azithromycin)，16元环主要有交沙霉素(Josamycin)、柱晶白霉素(Kitasamycin)、麦迪霉素(Midecamycin)、普拉特霉素(Platenomycin)、泰乐菌素(Ty 1sin)和螺旋霉素(Spiramycin)及其衍生物等。
[0003]必特螺旋霉素(Bi tespiramy cin )，又称可利霉素(Keli my cin)、生技霉素(Shengjimycin)，是一种酰化螺旋霉素所组成的多组分混合物，如图1所示，图1中，1.螺旋霉素m，2.单乙酰螺旋霉素11，3.单乙酰螺旋霉素111,4.丙酰螺旋霉素11,5.丙酰螺旋霉素III，6.(异)丁酰螺旋霉素11,7.异戊酰螺旋霉素I，8.(异)丁酰螺旋霉素111,9.异戊酰螺旋霉素II，10.异戊酰螺旋霉素III。必特螺旋霉素由工程菌Stmptomyces spiramyceticusWSJ-1产生，是国内首例具有自主知识产权的大环内酯类抗生素。必特螺旋霉素的药效试验表明，其对支原体及革兰氏阳性菌抑制活性较高，对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性，抗菌活性及治疗效果优于乙酰螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素。
[0004]必特螺旋霉素成品是由极性不同的酰化螺旋霉素和未知杂质所组成的混合物，各组分的极性差异致使杂质分布非常复杂，如图1。目前必特螺旋霉素的合格标准已明确规定，其规格为异戊酰螺旋霉素III > 30%，异戊酰螺旋霉素I+II+III > 60%，总酰化螺旋霉素? 80%，螺旋霉素< 1.0%，总未知杂质< 5.0%。由于极性接近的有效组分和杂质的性质极为相似，因此在分离提纯的过程中，极性相近的有效组分和未知杂质保持相同程度的去留趋势，将总未知杂质含量控制在不高于5%这一苛刻范围内已成为生产必特螺旋霉素合格品的难点。
[0005]对于多组分药物的分离提纯并无太多可以借鉴的成功案例。必特螺旋霉素作为国家一类新药，其组分复杂，目前已报道的关于分离提纯必特螺旋霉素的研究主要集中在溶媒萃取法、大孔树脂吸附法等工艺的研究。例如，中国发明专利CN101921302B公开了一种从发酵液中提取必特螺旋霉素的纯化工艺，该纯化方法通过萃取，尤其是通过缓冲盐溶液洗涤萃取相，去除了其中残留的螺旋霉素，优化了必特螺旋霉素的组分分配。中国发明专利CN103694295A公开了一种优化必特螺旋霉素组分的方法，通过膜分离、大孔树脂吸附洗脱、洗涤和萃取操作，采用分步结晶的方法从水相中提取必特螺旋霉素，可去除弱极性杂质并富集异戊酰螺旋霉素III。然而，针对如何去除组分间杂质并提高有效组分的含量，未见有相关报道。
[0006]在工业生产中，分离提纯必特螺旋霉素的工艺主要来源于生产螺旋霉素的工艺方法，即溶媒萃取法，该方法的基本原理为:必特螺旋霉素在不同的PH溶液中以不同的化学状态存在，基于这种特性，使必特螺旋霉素在不同溶媒中发生相转移，进而达到浓缩和提纯的目的。然而，溶媒萃取法对必特螺旋霉素单个组分没有选择特异性，加之其组分及杂质种类多、发酵液不稳定等因素，生产合格的必特螺旋霉素成品有很大的难度。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种分离提纯必特螺旋霉素的工艺方法，以制得必特螺旋霉素合格品。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0009]—种分离提纯必特螺旋霉素的工艺方法，该工艺方法包括以下步骤:
[0010](I)三级逆流洗涤:用磷酸盐溶液三级逆流洗涤含有必特螺旋霉素的酯提取液，得到含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液；
[0011](2)第一次反萃:用磷酸盐溶液反萃含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液，静置分液，得含有必特螺旋霉素的一次水提液；
[0012](3)酯萃取:用酯萃取含有必特螺旋霉素的一次水提液，静置分液，得到浓缩必特螺旋霉素的酯萃取液；
[0013](4)第二次反萃:用磷酸盐溶液反萃浓缩必特螺旋霉素的酯萃取液，静置分液，得含有必特螺旋霉素的二次水提液；
[0014](5)结晶:向含有必特螺旋霉素的二次水提液中，加入乙醇，滴加碱液结晶，得到必特螺旋霉素成品。
[0015]本发明中，用酯提取必特螺旋霉素发酵液得到含有必特螺旋霉素的酯提取液，含有必特螺旋霉素的酯提取液效价为7000-11000u/ml。
[0016]步骤(I)所述的三级逆流洗涤步骤中，三级逆流洗涤的温度为15?25°C，优选为20°C，洗涤相比为水相:酯相=1:1?1:2，优选为1:1.5;
[0017]逆流洗涤所用磷酸盐溶液为质量分数0.7%-1%的NaH2PO4溶液；
[0018]含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液效价为5000-9000u/ml。
[0019]步骤(2)所述的第一次反萃步骤中，反萃相比为水相:酯相=1:3.5-1:4.5，并调整水相pH至3.5-4.0，静置分液，使含有必特螺旋霉素的一次水提液效价为20000-26000u/mlu/ml ；
[°02°]第一次反萃步骤中，所用磷酸盐溶液为pH=2.0-2.3、质量分数为0.5-1.0%的NaH2PO4溶液。调节水相pH值采用磷酸溶液。
[0021]步骤(3)所述的酯萃取步骤中，用酯萃取前，调节含有必特螺旋霉素的一次水提液pH至6.8-7.0，酯萃取时萃取相比为水相:酯相=3:1-5:1，使浓缩必特螺旋霉素的酯萃取液效价为 75000-98000u/ml。
[0022]步骤(3)所述的酯萃取步骤中，所用的酯为乙酸丁酯。
[0023]步骤(4)所述的第二次反萃步骤中，反萃相比为酯相:水相=1:3-1:5，并调节水相的pH至2.8-3.0，静置分液，使含有必特螺旋霉素的二次水提液效价为13000u/ml-18000u/
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[0024]第二次反萃步骤中，所用磷酸盐溶液为pH=2.0-2.3，质量分数为0.5-1.0 %的NaH2PO4溶液。调节水相pH值采用磷酸溶液。
[0025]步骤(5)所述的结晶步骤中，首先调节含有必特螺旋霉素的二次水提液的pH至4.5-5.5，得到必特螺旋霉素的结晶液，此处由于结晶液的严格pH控制，使得杂质更多的留在母液中，提高结晶产品的纯度，然后向必特螺旋霉素的结晶液中加入乙醇，滴加碱液结晶，得到必特螺旋霉素成品。
[0026]调节pH值可以选用0.8?1.2mo I/1的NaOH溶液，在调节pH值以后，优选设置去除溶于其中微量酯的步骤，去除微量酯的方法可以采用向含有必特螺旋霉素的二次水提液中持续鼓入空气的方法。
[0027]向结晶液中加入乙醇的量为结晶液质量的6%_10%。
[0028]结晶过程中首先使用0.8?1.2(优选为1.0)mol/l的碱液滴定结晶液至刚出现沉淀，然后改用浓度为0.05?0.15(优选为0.1 )mol/l的碱液继续滴加结晶，控制结晶终点pH值为 7.5-8.0。
[0029]结晶完成后，进行抽滤，干燥，得到必特螺旋霉素成品。
[0030]本发明工艺方法中，所述的酯优选为乙酸丁酯。
[0031]本发明工艺方法，对含有必特螺旋霉素的料液进行三级逆流洗涤，利用两次水相萃取与一次酯相萃取，提取酯相中必特螺旋霉素至水相中，向水相中加入少量乙醇，利用低浓度氢氧化钠进行结晶。
[0032]本发明利用必特螺旋霉素在高pH值时溶于酯相，低pH值时溶于水相的特性，严格控制洗涤、萃取、结晶过程中的PH值等一系列关键技术参数，制备出异戊酰螺旋霉素III 230%、异戊酰螺旋霉素I+II+III > 60%、总酰化螺旋霉素? 80%、螺旋霉素< 1.0%、未知杂质< 5.0 %的必特螺旋霉素合格品。
[0033]本发明综合三级逆流洗涤、溶媒萃取、结晶液中加入少量乙醇、低浓度NaOH结晶的工艺操作，并严格控制各步骤包括PH在内的操作条件，可以得到总未知杂质含量低而有效组分含量高的必特螺旋霉素合格品，目前还未见有相关文献及公开专利报道。
[0034]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0035]I)本发明的工艺方法控制指标明确，可控性强，是对工业上溶媒萃取法的改进，可应用于大批量生产必特螺旋霉素的过程中。
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