]2)本发明多级逆流萃取，对从发酵液提取出的含有必特螺旋霉素的酯萃取液进行三级逆流洗涤，实现对萃取液的梯度洗涤，使必特螺旋霉素各组分在水酯两相中的分配系数和选择性系数达到理想值，可大大减少洗涤次数。
[0037]3)本发明所使用的溶媒萃取法，使必特螺旋霉素在水酯两相中转移，通过控制水酯两相的相比和关键操作参数PH值，将强极性杂质富集在第二次溶媒乙酸丁酯中，可有效降低未知杂质并提高有效组分的含量，解决了发酵液中异戊酰螺旋霉素III等有效组分含量低的问题，并进一步攻克了传统溶媒萃取法去除未知杂质的难关。
[0038]4)本发明在结晶过程中，向结晶液中加入乙醇，乙醇是弱极性溶剂，通过改变结晶液的极性，可以达到优化必特螺旋霉素各组分的目的。
[0039]5)本发明所使用的低浓度氢氧化钠结晶工艺，消除了结晶过程中局部过碱的隐患，使析出的结晶晶型更加有序，提高了最终产品的品质。此外，低浓度的碱液对结晶液有很大的稀释作用，使溶解平衡方程中的必特螺旋霉素分子及与必特螺旋霉素性质相似的未知杂质更多解离为离子，这使得母液中保留了更多的杂质，这一操作可有效去除有效组分之间的杂质，从而在一定程度上提高了结晶产品中有效组分的含量。
[0040] 6)本发明必特螺旋霉素提取工艺，以未知杂质的去除和有效组分含量的提高作为整个工艺的重点，对提取工艺中各个环节的操作参数进行优化，大大提高了必特螺旋霉素成品的合格率。
【附图说明】
[0041 ]图1为必特螺旋霉素成品高效液相色谱图(HPLC);
[0042]图2为本发明分离提纯必特螺旋霉素的工艺流程图；
[0043]图3为实施例1所得必特螺旋霉素合格成品的高效液相色谱(HPLC)图谱；
[0044]图4为实施例2所得必特螺旋霉素合格成品的高效液相色谱(HPLC)图谱；
[0045]图5为实施例3所得必特螺旋霉素合格成品的高效液相色谱(HPLC)图谱。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0047]本发明的工艺流程如图2所示，含有必特螺旋霉素的酯提取液，用磷酸盐溶液三级逆流洗涤，得到含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液;含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液，用磷酸盐溶液进行第一次反萃，静置分液，得含有必特螺旋霉素的一次水提液;含有必特螺旋霉素的一次水提液，用酯溶媒萃取，静置分液，得到浓缩必特螺旋霉素的酯萃取液;浓缩必特螺旋霉素的酯萃取液，用磷酸盐溶液进行第二次反萃，静置分液，得含有必特螺旋霉素的二次水提液;调节二次水提液的PH值，得到必特螺旋霉素的结晶液，然后向必特螺旋霉素的结晶液中加入乙醇，滴加低浓度碱液结晶，结晶完成后，进行抽滤，干燥，得到必特螺旋霉素成品O
[0048]实施例1:
[0049](I)三级逆流洗涤:含有必特螺旋霉素效价为7234u/ml的乙酸丁酯提取液，用质量分数为0.8%的NaH2PO4溶液经三级离心机进行逆流洗涤。洗涤温度为20°C，洗涤相比为水相:酯相=1: 1.5，得到酯相效价为5593u/ml的必特螺旋霉素洗后液。
[0050](2)缓冲液反萃:分离出的乙酸丁酯洗后液用pH=2.2、质量分数为0.7%的NaH2PO4溶液反萃，反萃相比为水相:酯相= 1:4.5，水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH至3.60，静置分液，得到水相效价为21708u/ml的必特螺旋霉素反萃液。
[0051 ] (3)乙酸丁酯萃取:调节必特螺旋霉素水相反萃液PH至6.80，用乙酸丁酯萃取，萃取相比为水相:酯相=5:1，静置分液，得到浓缩必特螺旋霉素的乙酸丁酯萃取液，酯相效价为87040u/ml。
[0052](4)缓冲液反萃:缓冲液特性同(2)，反萃相比为酯相:水相= 1:5，水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH值至2.85，静置分液，得到水相效价为15364u/ml的必特螺旋霉素水相反萃液。用1.0mol/Ι的NaOH回调水相pH至4.95，得必特螺旋霉素的结晶液。
[0053](5)结晶:向结晶液中加入质量分数为结晶液6%的乙醇，结晶过程中首先使用1.0mo I /1的NaOH滴定结晶液至刚出现沉淀，然后改用浓度为0.1 mo I /1的NaOH继续滴加结晶，控制终点pH值为7.70 ο抽滤，干燥，得必特螺旋霉素成品。
[0054]用高效液相色谱对结晶产品进行梯度洗脱，如图3所示，测得必特螺旋霉素含量为:异戊酰螺旋霉素III为32.52%,异戊酰螺旋霉素I+II+III为68.99%,总酰化螺旋霉素为93.05%，螺旋霉素为0%，总未知杂质为4.11%。所得结晶产品含量达到合格标准。
[0055]实施例2:
[0056](I)三级逆流洗涤:含有必特螺旋霉素效价为9078u/ml的乙酸丁酯提取液，用1%NaH2PO4溶液经三级离心机进行逆流洗涤。洗涤温度为20°C，洗涤相比为水相:酯相=1: 1.5，得到酯相效价为5249u/ml的必特螺旋霉素洗后液。
[0057](2)缓冲液反萃:分离出的乙酸丁酯洗后液用pH=2.2的0.7%NaH2P04溶液反萃，反萃相比为水相:酯相=I:4，水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH至3.85，静置分液，得到水相效价为20468u/ml的必特螺旋霉素反萃液。
[0058](3)乙酸丁酯萃取:调节必特螺旋霉素水相反萃液PH至7.00，用乙酸丁酯萃取，萃取相比为水相:酯相=3:1，静置分液，得到浓缩必特螺旋霉素的乙酸丁酯萃取液，酯相效价为77040u/ml。
[0059](4)缓冲液反萃:缓冲液特性同(2)，反萃相比为酯相:水相= 1:3，水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH值至2.90，静置分液，得到水相效价为14078u/ml的必特螺旋霉素水相反萃液。用1.0mol/Ι的NaOH回调水相pH至5.05，得必特螺旋霉素的结晶液。
[0060](5)结晶:向结晶液中加入质量分数为结晶液8%的乙醇。结晶过程中首先使用1.0mo I /1的NaOH滴定结晶液至刚出现沉淀，然后改用浓度为0.1 mo I /1的NaOH继续滴加结晶，控制终点pH值为7.85。抽滤，干燥，得必特螺旋霉素成品。
[0061]用高效液相色谱对结晶产品进行梯度洗脱，如图4所示，测得必特螺旋霉素含量为:异戊酰螺旋霉素III为35.26%,异戊酰螺旋霉素I+II+I II为67.26%,总酰化螺旋霉素为98.03%,螺旋霉素为0.05%,总未知杂质为3.28 %。所得结晶产品含量达到合格标准。
[0062]实施例3:
[0063](I)三级逆流洗涤:含有必特螺旋霉素效价为8578u/ml的乙酸丁酯提取液，用
0.9%NaH2P04溶液经三级离心机进行逆流洗涤。洗涤温度为20°C，洗涤相比为水相:酯相=1:1.5，得到酯相效价为6091u/ml的必特螺旋霉素洗后液。
[0064](2)缓冲液反萃:分离出的乙酸丁酯洗后液用pH=2.2的0.7%NaH2P04溶液反萃，反萃相比为水相:酯相=1:3.5,水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH至3.75，静置分液，得到水相效价为20972u/ml的必特螺旋霉素反萃液。
[0065](3)乙酸丁酯萃取:调节必特螺旋霉素水相反萃液PH至6.90，用乙酸丁酯萃取，萃取相比为水相:酯相= 4:1，静置分液，得到浓缩必特螺旋霉素的乙酸丁酯萃取液，酯相效价为79140u/mlo
[0066](4)缓冲液反萃:缓冲液特性同(2)，反萃相比为酯相:水相= 1:4，水酯混合搅拌，用H3PO4调水相pH值至2.80，静置分液，得到水相效价为12920u/ml的必特螺旋霉素水相反萃液。用1.0mol/Ι的NaOH回调水相pH至5.30，得必特螺旋霉素的结晶液。
[0067](5)结晶:向结晶液中加入质量分数为结晶液10%的乙醇。结晶过程中首先使用
1.0mo I /1的NaOH滴定结晶液至刚出现沉淀，然后改用浓度为0.1 mo I /1的NaOH继续滴加结晶，控制终点pH值为7.75ο抽滤，干燥，得必特螺旋霉素成品。
[0068]用高效液相色谱对结晶产品进行梯度洗脱，如图5所示，测得必特螺旋霉素含量为:异戊酰螺旋霉素III为46.69%，异戊酰螺旋霉素I+II+III为65.23%,总酰化螺旋霉素为87.73%,螺旋霉素为0.03%,总未知杂质为3.65 %。所得结晶产品含量达到合格标准。
[0069]实施例4:
[0070]—种分离提纯必特螺旋霉素的工艺方法，该工艺方法包括以下步骤:
[0071](I)三级逆流洗涤:用酯提取必特螺旋霉素发酵液得到含有必特螺旋霉素的酯提取液，含有必特螺旋霉素的酯提取液效价为7000u/ml ο用质量分数0.8 %的NaH2PO4溶液三级逆流洗涤含有必特螺旋霉素的酯提取液，三级逆流洗涤的温度为15°C，洗涤相比为水相:酯相=1:1，得到含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液，其中含有必特螺旋霉素的洗后酯溶液效价为5000u