一种鉴别诊断急性支原体、细菌和病毒感染的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及试剂盒诊断技术领域，具体地，涉及一种能够鉴别诊断急性支原体、细菌或病毒感染的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]在临床急性呼吸/消化道感染患者中，绝大多数是由细菌、支原体和病毒感染所致，其中呼吸道感染支原体所占比例最大、病毒次之、细菌最小。上述三种病原体对抗生素的敏感性各不相同:其中细菌具有细胞壁，对干扰细胞壁合成的青霉素和头孢霉素类抗生素敏感；支原体无细胞壁，对干扰蛋白质合成的红霉素和螺旋霉素类抗生素敏感，而对青霉素和头孢霉素类抗生素抵抗；病毒是一类非细胞型微生物，只含一种类型核酸(DNA或RNA)和相关衣壳蛋白，它们对各类抗生素抵抗，即病毒感染后用抗生素治疗无效。若能及时准确对上述病原体进行鉴别诊断，则可有效指导抗生素在临床的合理使用。
[0003]滥用或不适当使用抗生素是诱导细菌产生耐药性的一个重要原因。欧盟国家统计每年因细菌耐药导致死亡的人数约2.5万，直接经济损失达15亿欧元；我国是滥用抗生素较为严重的国家之一，每年约8万人因滥用抗菌药物而死亡。滥用抗生素造成细菌耐药的原因很多，其中临床缺乏快速、简便、有效鉴别诊断急性细菌、支原体和病毒感染的检测方法是重要原因之一。并由此导致急性呼吸/消化道患者特别是病情变化急剧的婴幼儿患者入院就诊后，医务工作者为迅速控制病情发展保证患者生命安全，同时也为了避免出现医患纠纷或承担万一发生严重后果的责任，通常大多不加区分地采用抗生素进行治疗，此种情况在基层医疗单位更为普遍和严重。因此研制一种能够快速有效鉴别诊断临床急性呼吸/消化道支原体、细菌和病毒感染的新方法，对克服上述抗生素滥用或使用不当的医疗现状具有非常重要的意义。
[0004]传统病原体分离培养方法是鉴别诊断不同病原微生物感染的金标准，但这种检测方法所需时间长(多7天)，不能满足临床对病原体快速鉴别诊断的需求；此外，抗生素在临床广泛而不适当的使用也导致该法对病原体的阳性检出率明显下降。常规嗜中性粒细胞计数方法对鉴别急性细菌与病毒感染有一定意义，鉴于人嗜中性粒细胞正常值介于4000-10000个/mm3之间，因此只有嗜中性粒细胞数大于10000个/mm3时才对急性细菌性感染具有明确诊断意义，此外该法虽然简单，但仍需制备血涂片并在显微镜下计数才能完成。
[0005]C-反应蛋白(c-reactive protein, CRP)是 Til let 等(1930 年)在急性炎症患者血清中发现的一种能与肺炎球菌细胞壁C-多糖结合发生反应的蛋白。CRP作为一种急性期反应蛋白在正常人血浆中含量较低(〈10 μ g/ml)，在急性感染、创伤、某些心血管疾病或发现恶性肿瘤时其含量显著升高。早期研究发现，急性细菌感染患者血清中CRP浓度显著升高，而在急性病毒感染时患者血清中CRP浓度变化不大。因此，曾将CRP浓度升高作为临床鉴别诊断急性细菌感染还是急性病毒感染的一个指标。随后大量临床检测发现除急性细菌感染患者外，相当数量急性病毒和支原体感染患者血清中CRP浓度也显著升高。目前认为患者血清CRP浓度升高对鉴别急性细菌感染还是急性病毒感染仅有一定的辅助诊断意义。
[0006]降|丐素原(procalcitonin，PCT)是Jacbbs等(1981年)首次在重症感染患者血楽中发现的一种糖蛋白，此种糖蛋白在健康人血浆中含量极低(〈0.5ng/ml)，几乎检测不到。1993年Assicot首次报道在重症细菌患者感染血浆中PCT含量显著升高，而在重症病毒和支原体感染患者血浆中PCT含量不升高或轻微升高。此后PCT含量显著升高就成为重症细菌感染、败血症或脓毒血症的一个重要检测指标，用于临床诊断和指导抗生素的合理使用。发明人检测发现急性重症细菌性肺炎患者血清中PCT含量显著升高，而在急性轻症细菌性肺炎与急性支原体或病毒性肺炎患者血清中的PCT含量无明显差异。上述结果表明血浆/血清中PCT含量显著升高对临床重症细菌感染的诊断具有重要意义，而对临床轻症细菌感染与轻症病毒或支原体感染没有鉴别诊断意义。
[0007]脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebinding protein, LBP)是 Tobias 等(1986年)首次从急性炎症反应兔血清中分离纯化的一种阳离子蛋白，因其能与细菌脂多糖(LPS)结合故名。随后Roeder等(1989年)又从人和其他动物体内分离获得各自的脂多糖结合蛋白。人LBP作为I型急性期反应蛋白在正常人血浆中含量较低(5-10yg/ml)，感染时其含量显著升高。发明人检测发现，急性细菌性肺炎患者血清中LBP含量为28.614±7.280 ;急性支原体肺炎患者血清中LBP含量为30.601±13.015 ;急性病毒性肺炎患者血清中LBP含量为26.301 ±7.128。上述研究结果表明:人血液中LBP作为一种急性感染相关生物标志物，有可能用于临床急性感染性疾病的诊断，而不适用于对急性细菌、支原体和病毒感染的鉴别诊断。
[0008]血小板衍生的生长因子(plateletderived growth factor, FOGF)是Antoniades等(1979年)首次从人血小板中分离纯化的一种分子量为31KD糖蛋白。此种糖蛋白由两条肽链组成，具有三种不同的二聚体结构，即H)GF-AA、roGF-BB和TOGF-AB。最初发现TOGF以α颗粒形式存在于血小板中，接受刺激后可迅速释放出来对相邻结缔组织细胞产生促有丝分裂效应，启动和促进组织创伤修复。随后证实体内单核-巨噬细胞是主要合成分泌TOGF的细胞，此外成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经细胞、肝星形细胞和某些肿瘤细胞也可合成分泌TOGF。动物和临床研究发现在低氧压、凝血酶、某些生长因子和细胞因子作用下，不仅能够诱导结缔组织细胞产生TOGF启动和促进组织创伤修复，还能(1)诱导肿瘤细胞产生roGF，以自分泌方式促进肿瘤生长形成肿瘤；(2)诱导肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞产生roGF，以旁分泌方式参与和促进肺纤维化的形成(3)诱导血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和相关巨噬细胞产生roGF，以自分泌和旁分泌方式参与和促进动脉粥样硬化的形成。此外发现roGF水平升高还与肝纤维化、骨髓纤维化、系统性硬化症、哮喘和妊娠反应等疾病的发生密切相关。但迄今为止尚未见到roGF水平升高与急性感染性疾病相关的研究报告。
[0009]呼吸道和消化道是病原体侵入机体的重要门户，鉴于(1)不同病原体对肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等相关细胞的刺激作用可能有所不同；
(2)动物研究发现肺炎支原体反复感染可使大鼠肺组织中roGF-BB表达水平显著升高，并由此导致大鼠肺间质纤维化形成；(3)申请人采用B1-plex悬液芯片技术检测发现急性支原体感染肺炎患者血清中TOGF含量较急性细菌或病毒感染肺炎患者显著升高；申请人提出以人roGF作为急性感染相关生物标志物，对临床急性支原体、细菌和病毒感染进行诊断或鉴别诊断的新思路、新方法。
[0010]杀菌/ 渗透增强蛋(bactericidal/permeability-1ncreasing protein, BPI)是Weiss等(1978年)首次从人嗜中性粒细胞中分离获得的一种分子量为55KDa的阳离子抗菌蛋白。随后发现BPI不仅存在于人嗜中性粒细胞中，也存在于人粘膜上皮细胞和成纤维细胞中。研究证实，人BPI能与细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结合介导产生中和内毒素(LPS)和杀伤革兰阴性菌等抗感染免疫效应。生理条件下血浆中BPI含量较低，感染时其含量显著升高。研究表明，感染时BPI含量升高是病原体直接对粘膜上皮细胞、成纤维细胞和中性粒细胞刺激作用所致。呼吸/消化/泌尿生殖道是病原体侵入人体的重要门户。鉴于(I)不同病原体对上述相关粘膜上皮细胞和成纤维细胞的刺激作用有所不同，通常大分子颗粒性病原体对相关粘膜上皮细胞的刺激作用大于小分子可溶性病毒；(2)细菌感染后还可促进嗜中性粒细胞生成，并直接刺激嗜中性粒细胞高表达BPI，而病毒感染通常不能产生上述作用；(3)申请人采用BPI ELISA试剂盒检测发现急性细菌感染肺炎患者血清中BPI含量较急性病毒感染肺炎患者显著升高；申请人提出以人BPI作为急性感染相关生物标志物，对临床急性细菌感染与急性病毒感染进行诊断或鉴别诊断的新思路、新方法。
【发明内容】
[0011]本发明目的在于提供一种能够对临床急性支原体、细菌或病毒感染进行快速鉴别诊断的试剂盒，为指导医务工作者及时准确合理使用抗生素治愈相关疾病，避免滥用抗生素造成细菌耐药提供可靠的技术支持。
[0012]本发明采用B1-plex悬液芯片技术对病原学诊断明确的93份急性肺炎患者血清标本进行检测，统计结果发现若以6000pg/ml的TOGF作为鉴别诊断急性支原体感染与急性病毒或细菌感染的检测基线值，支原体阳性检出率与病毒或细菌感染后出现的支原体假阳性检出率具有非常显著性差异；本发明还采用BPI ELISA试