志物，对急性细菌感染与急性病毒感染具有较好的鉴别诊断意义；对急性细菌感染与急性支原体感染鉴别诊断效果较差，鉴于通过实施例1中对血清TOGF值的检测已将急性支原体感染与急性细菌感染有效鉴别区分，因此实施例2中(3)检测结果并不影响本试剂盒中血清I3DGF值和血清BPI值综合检测结果对支原体、细菌和病毒三种病原体的鉴别诊断。
[0046]实施例3 PDGF与BPI联合作为鉴别诊断急性感染病原体标志物的应用
[0047]1、鼠抗人TOGF和BPI单克隆抗体的制备
[0048]单克隆抗体制备简述如下:(1)取50 μ g/0.1ml纯化人F1DGF(购自abeam公司，abl55718)和 50 μ g/0.1ml 纯化人 BPI (购自 abeam 公司，abl36598)分别与 10 μ g/0.1ml弗氏完全佐剂混合，充分乳化后腹腔注射BALB/c小鼠进行初次免疫；2周后按上法(用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂)腹腔注射、加强免疫3次、相隔2-3周，第3次加强免疫后3-4天取小鼠免疫脾细胞(B细胞)。(2)在聚乙二醇作用下使上述免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经HAT选择培养后获得相应杂交瘤细胞。(3)将上述杂交瘤细胞单克隆化后筛选出阳性杂交瘤细胞，通过培养获得鼠抗人I3DGF和BPI单克隆抗体。
[0049]2、胶体金快速检测试纸卡组成及其鉴别诊断检测基线值的确定
[0050]本发明研制的胶体金快速检测试纸卡包括测试纸卡I和测试纸卡II，二者分别用于定性检测人血清中I3DGF含量和BPI含量。根据实施例1和实施例2的研究结果，测试纸卡I将6000pg/ml PDGF作为鉴别诊断急性支原体感染与急性病毒感染或细菌感染的检测基线值；测试纸卡II将80ng/ml BPI作为鉴别诊断急性细菌感染与病毒感染的检测基线值。
[0051 ] 3、胶体金快速检测试纸卡的制备
[0052](I)首先将鼠抗人TOGF/BPI单克隆抗体分别吸附在胶体金颗粒上获得胶体金致敏抗体复合物，然后再将上述复合物松弛附着在玻璃纤维膜上，获得包被鼠抗人TOGF/BPI单克隆抗体一胶体金复合物的结合物释放垫。
[0053](2)将鼠抗人TOGF/BPI单克隆抗体及羊抗鼠IgG第二抗体分别吸附在硝酸纤维素膜上检测线处和质控线处，制备获得反应膜。
[0054](3)将(I)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成用于检测人I3DGF和BPI的侧试纸卡I和II。
[0055]4、胶体金快速检测试纸卡的结果分析判定
[0056]在测试纸卡质控线呈现紫红色条带，即呈阳性反应情况下:①测试纸卡I检测线处出现一条紫红色条带或测试纸卡I和II检测线处各出现一条紫红色条带，诊断为急性支原体感染；②测试纸卡I检测线处无紫红色条带出现而在测试纸卡II检测线处出现一条紫红色条带，诊断为急性细菌感染；③测试纸卡I和II检测线处均无紫红色条带出现，诊断为急性病毒感染。测试纸卡质控线处无紫红色条带出现，视为实验无效。
[0057]5、临床实际检测结果
[0058]对30份急性肺炎患者血清标本进行检测，上述血清标本已采用传统方法检测确定:16份来自急性支原体感染患者(血清标本编号分别为1-16号)，9份来自急性流感病毒感染患者(血清标本编号分别为17-25号)，3份来自急性肺炎链球菌感染患者(血清标本编号为26-28号)，2份来自流感嗜血杆菌感染患者(血清标本编号为29-30号)。
[0059]采用本实施例中检测人H)GF和人BPI的测试纸卡I和II对30份血清标本进行检测，结果显示:
[0060]在1-16号血清样品(急性支原体感染)中，除10号血清样品外，其他15份血清样品在测试纸卡I检测线处(检测roGF)均出现一条紫红色条带；其中1-4号，9、12、13号血清样品在测试纸卡II检测线处(检测BPI)也出现一条紫红色条带。上述结果与本试剂盒对急性支原体感染鉴别诊断结果判读标准相符。据此采用本发明试剂盒检测急性支原体感染准确率为15/16X100%= 93.7%。
[0061]17-25号血清样品(急性病毒感染)在测试纸卡I检测线处(检测TOGF)均无紫红色条带出现；在上述血清样品中，除21号血清样品外，其他8份血清样品在测试纸卡II检测线处(检测BPI)均无紫红色条带出现。上述结果与本试剂盒对急性病毒感染鉴别诊断结果判读标准相符。据此采用本发明试剂盒检测急性病毒感染准确率为8/9X100% =88.
[0062]26-30号血清样品(急性细菌感染)在测试纸卡I检测线处(检测TOGF)均无紫红色条带出现；在测试纸卡II检测线处(检测BPI)均出现一条紫红色条带。上述结果与本试剂盒对急性细菌感染鉴别诊断结果判读标准相符。据此采用本发明试剂盒检测急性细菌感染准确率为5/5X100%= 100%。
[0063]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种鉴别诊断支原体、细菌或病毒急性感染的试剂盒，包括分别检测人roGF值和人BPI值的试剂盒或试纸卡。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为胶体金检测试剂盒、ELISA试剂盒、免疫沉淀法试剂盒或免疫比浊法试剂盒。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的检测对象为急性感染患者的血清、血浆、全血、尿液、脑脊液或其肺泡灌洗液样品。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的急性感染包括急性呼吸道感染、急性消化道感染、急性泌尿生殖道感染和/或相关病原体慢性感染活动期或急性发作的感染。5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，检测血清TOGF值的试剂盒或试纸卡其检测基线值为6000pg/ml ;检测血清BPI值的试剂盒或试纸卡其检测基线值为80ng/ml ο6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于， 若检测血清样品的roGF含量大于6000pg/ml，则待测样品来自急性支原体感染患者； 若检测血清样品的BPI含量大于80ng/ml，则待测样品来自急性细菌感染患者； 若检测血清样品的TOGF含量小于6000pg/ml，且BPI含量小于80ng/ml，则待测样品来自急性病毒感染患者。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括分别检测血清H)GF含量的胶体金测试纸卡和检测血清BPI含量的胶体金测试纸卡， 检测血清roGF含量的胶体金试纸卡为测试纸卡I，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜为硝酸纤维素膜，具有包被鼠抗人roGF单克隆抗体的检测线和包被二抗IgG的质控线；所述结合物释放垫为玻璃纤维膜，包被有胶体金标记的鼠抗人roGF单克隆抗体； 检测血清BPI含量的胶体金试纸卡为测试纸卡II，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜为硝酸纤维素膜，具有包被鼠抗人BPI单克隆抗体的检测线和包被二抗IgG的质控线；所述结合物释放垫为玻璃纤维膜，包被有胶体金标记的鼠抗人BPI单克隆抗体； 当测试纸卡I检测线处出现一条紫红色条带或测试纸卡I和II检测线处各出现一条紫红色条带，鉴定为急性支原体感染； 当测试纸卡I检测线处无紫红色条带出现，测试纸卡II检测线处出现一条紫红色条带，鉴定为急性细菌感染； 当测试纸卡I和II检测线处均无紫红色条带出现，鉴定为急性病毒感染。8.PDGF和BPI在制备检测急性感染中病原体为支原体、细菌或病毒的试剂盒中的应用。9.一种用于检测急性感染中病原体为支原体、细菌或病毒的生物标志物，其为人TOGF和人BPI，其中血清roGF检测基线值为6000pg/ml，血清BPI检测基线值为80ng/ml。10.—种用于检测急性感染中病原为支原体的生物标志物，其为人TOGF，其中血清PDGF检测基线值为6000pg/ml。
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴别诊断急性支原体、细菌和病毒感染的胶体金试剂盒及其应用。该试剂盒含有分别检测人PDGF和人BPI的试纸卡；以患者血清为检测对象：以血清PDGF值6000pg/ml为诊断基线值，待检血清PDGF值＞6000pg/ml判定为支原体感染；以血清BPI值80ng/ml为诊断基线值，待检血清BPI值＞80ng/ml判定为细菌感染；待检血清PDGF值和BPI值分别小于6000pg/ml和80ng/ml判定为病毒感染。该试剂盒操作简便、结果易于判读，且成本低廉，能够有效鉴别诊断急性呼吸道支原体、细菌和病毒感染，指导临床合理使用抗生素，降低或减少耐药菌的产生，适于推广使用。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105242049
【申请号】CN201510587876
【发明人】安云庆, 曹彬
【申请人】安云庆
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年9月15日