黄曲霉毒素b1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉侵染农产品及食品产生的有毒次生代谢产物，从I960年人们首次发现黄曲霉毒素开始，至今已经发现的黄曲霉毒素多达20种。其中，黄曲霉毒素B1是污染植物性农产品的主要类型，且毒性最强，是氰化钾10倍，属I类致癌物。黄曲霉毒素B1污染的饲料被动物食用后，还能在动物体内转化为肉蛋奶中的M1，污染整个食物链。因此，黄曲霉毒素B1检测技术研究对于保障人类的健康和生命安全具有重要意义。
[0003]现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层色谱法、微柱筛选法、免疫亲和-高效液相色谱法、免疫亲和-液相色谱-串联质谱法、免疫亲和-荧光光度法和酶联免疫吸附法。上述方法中的薄层色谱法、微柱筛选法、免疫亲和-高效液相色谱法、免疫亲和-液相色谱-串联质谱法和免疫亲和-荧光光度法，较适合专业实验室内检测。但是随着人民对食品安全需求的不断提高，为防止黄曲霉毒素B1进入食物链，急需一种能对食品及农产品的生产、储存、加工和运输多环节快速、简单、批量的现场筛查方法。酶联免疫吸附法和免疫层析法是近年来基于上述需求发展起来的黄曲霉毒素B1检测方法。免疫层析法比酶联免疫吸附法所需时间更短，操作步骤更少，对操作人员的专业要求更低，因此，在真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测上已经得到了广泛应用。目前，市面上已经有许多针对黄曲霉毒素单一组分和多组分的纳米金免疫层析快速检测产品，但是纳米金作为贵金属，有成本高、制备条件严苛、批量产量不大的缺点，不利于黄曲霉毒素纳米金免疫层析检测试纸条的成本降低、批间均一化和市场化。随着纳米材料的不断发展，氧化石墨烯作为一种二维的碳纳米材料，经过近年来的科学研究和市场开发，具有成本低廉，可大批量生产，保存时间长的特点。因此，研究建立一种基于氧化石墨烯的黄曲霉毒素免疫层析试纸条，取代现有的纳米金试纸条，对于降低试纸条的成本，促进检测产品的市场化和监控食品和农产品中的黄曲霉毒素具有很重要的社会意义和巨大的应用价值和前景。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用。该试纸条用于检测黄曲霉毒素B1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高、成本低廉的特点。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为:
[0006]黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于:它包括层析试纸条和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，其中:所述的层析试纸条(见图1和图2)包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)。
[0007]按上述方案，所述的吸水垫长40?45mm，宽3?5mm ;检测垫长22?28mm，宽3?5mm ;样品垫长12?16mm，宽3?5mm，相邻各垫的交叠长度为1?3mm ;所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为5?10mm，质控线和检测线的间距为8?12mm。
[0008]按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。
[0009]按上述方案，所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360?600ng ;每厘米宽度试纸条质控线上所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300?420ng。
[0010]按上述方案，所述羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中所用的羧基化氧化石墨烯的片层大小为0.5?2 μπι ;所述每厘米宽度试纸条检测所需的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素Β1单克隆抗体的用量为15?750ng，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体中羧基化氧化石墨烯和抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体质量比为20:3?200:3。
[0011]如上所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤:
[0012]层析试纸条的制备:
[0013](1)吸水垫的制备
[0014]将吸水纸剪裁即得吸水垫；
[0015](2)检测垫的制备
[0016]检测线的包被:
[0017]将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)用包被缓冲液配制成浓度为0.6?lmg/mL的包被液；于距样品垫上沿5?10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360?600ng，然后于37°C条件下干燥30?60分钟；
[0018]质控线的包被:
[0019]将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成浓度为0.5?0.7mg/mL的包被液；于距检测线8?12mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300?420ng，然后于37°C条件下干燥30?60分钟；
[0020](3)样品垫的制备
[0021]将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37°C条件下干燥4?6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
[0022](4)试纸条的组装
[0023]在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1?3mm，即得层析试纸条；
[0024]和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的制备:将羧基化氧化石墨烯的羧基基团与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体上的氨基基团经共价偶联而得。
[0025]按上述方案，所述试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1 -牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为:每10mL中含有牛血清白蛋白0.lg，叠氮化钠0.002g，氯化钠(λ 08g，十二水磷酸氢二钠(λ 029g，氯化钾0.002g,磷酸二氢钾(λ 002g ；
[0026]配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为??每10mL中含有叠氮化钠0.002g,氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠(λ 029g，氯化钾0.002g,磷酸二氢钾0.002g ；
[0027]所述试纸条的制备中使用的封闭液为:每lOOmL中含有卵清白蛋白2g，蔗糖2.5g，辛基苯基聚氧乙烯醚(曲拉通X-100)0.lmL，聚乙烯吡咯烷酮-K30 0.3g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02go
[0028]按上述方案，所述的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂具体可按照以下方法制备得到的:取羧基化氧化石墨烯，在标记反应液中冰浴超声分散均匀，分散均匀时间一般可为5-10分钟；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，剧烈振摇，将羧基活化，活化时间一般可为15-30min ;然后缓慢加入抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续振摇，进行氧化石墨烯的羧基和抗体上的氨基的共价偶联反应，一般所需时间可为4-8h ;再加入牛血清白蛋白水溶液振摇以封闭多余活性位点；13000r/min以上转速离心，离心时间可为30_60min，弃去上清液，保留沉淀，洗涤后处理；加入标记保存液，即得羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，冷藏备用。冷藏置4°C冰箱即可。
[0029]按上述方案，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的质量浓度为30?300 μ g/mL。
[0030]按上述方案，羧基化氧化石墨烯在标记反应液中的浓度为0.5mg/mL, 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液浓度至少达到10mg/mL，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液浓度不高于lmg/mL，牛血清白蛋白水溶液的浓度不低于0.08g/mL，羧基化氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体和牛血清白蛋白的质量比为400:300:6?60:10000 ；
[0031]所述的标记反应液为??每1L中含有硼酸0.3092g,氢氧化钠若干，使终溶液pH值为 8.13 ;
[0032]所述的标记洗涤液为:每100mL中含有硼酸0.03092g，牛血清白蛋白lg，叠氮化钠0.02g,氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13 ;
[0033]所述的标记保存液为??每100mL中含有硼酸0.6184g，牛血清白蛋白lg，叠氮化钠0.02g，氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13。
[0034]按上述方案，所述的洗涤后处理为:加入标记洗涤液离心洗涤，将沉淀重悬，再以13000r/min以上转速离心30_60min，弃去上清液，重复上述操作3次；洗涤过程中羧基化氧化石墨烯在标记洗涤液的浓度不高于0.4mg/mL。
[0035]所述的羧基化氧化石墨烯是按照下述方法制备得到的:先将鳞片石墨采用化学氧化法制备氧化石墨，然后通过高强度超声处理解离成单层或少层的氧化石墨烯，再经离心选取13000rpm以上离心30min不沉淀的上清溶液，得到氧化石墨稀悬池液，在氧化石墨稀悬浊液中加入氢氧化钠和氯乙酸，经过羧基化超声处理将氧化石墨烯片层上的羟基转变成羧酸，经过透析纯化，再经离心选取13000rpm以上离心30min不沉淀的上清溶液，得到羧基化氧化石墨烯。
[0036]按上述方案，所述的化学氧化法为在鳞片石墨中加入硫酸和磷酸组成的混酸及高锰酸钾，进行初步氧化反应，然后通过水解反应形成膨胀的氧化石墨，后用双氧水、盐酸和去离