基于磺化石墨烯的DNA荧光检测方法及其试剂盒与流程

本发明涉及一种基于磺化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术：

氧化石墨烯可视为一种非传统形态的单一的原子层软性材料，可在横向尺寸上扩展到数十微米，具有聚合物、胶体、薄膜以及两性分子的特性。研究结果表明氧化石墨烯整个基面主体由两个不同区域构成，分别为未被氧化的芳香苯环和封闭的脂肪族六元环，羟基、环氧基团以及大量sp2 C-C结构单元存在于氧化石墨烯表面，羧基、羰基存在于氧化石墨烯边缘。氧化石墨烯的结构决定其能够通过键堆叠作用对带有裸露的环状结构的化合物（核酸碱基、芳香族化合物）产生强烈的非共价吸附。ss-DNA中的碱基包含六元环结构，石墨烯会与裸露的碱基发生强烈的π-π*相互作用、疏水作用等，从而吸附ss-DNA。但是，石墨烯结合不同分子结构的DNA的能力明显不同。研究表明，荧光标记的单链DNA探针能够快速、有效地吸附在氧化石墨烯的表面，由于氧化石墨烯荧光猝灭性质，只显示出弱的荧光信号；体系中存在靶序列DNA时，靶序列DNA与探针DNA杂交形成螺旋状双链DNA分子，由于DNA杂交后空间结构发生改变，磷酸盐骨架将碱基有效屏蔽在其中，使石墨烯无法与碱基接触，从而造成结合能力的减弱，使得荧光标记的DNA探针从氧化石墨烯表面释放，而显示出强的荧光信号。通过荧光信号强弱变化可以高效测定特定序列的DNA的含量。

由以上可知，氧化石墨烯还原程度越高sp2杂化的晶域恢复越完全其对单链DNA的荧光猝灭效果就越高。但是，单纯的还原氧化石墨烯虽然可使其sp2杂化的晶域恢复却因含氧基团的离去降低了其在水中的溶解性。这大大限制了氧化石墨烯的还原程度及还原氧化石墨烯在生物领域、环境监测及临床医学中的应用。

本发明提供了一种基于磺化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒。磺化石墨烯在具有高还原程度的同时具有良好的水溶性。本发明所构建的方法具有特异性好、灵敏度高、背景信号低等突出优点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种基于磺化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒。试剂盒中包括磺化石墨烯溶液（a液），探针链DNA溶液（b液）。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于磺化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是将6-羧基荧光素标记单链DNA与目标链DNA加入到Tris-HCl缓冲液中，杂交反应后加入磺化石墨烯，室温反应，测定520 nm处的荧光强度，激发波长为494 nm；所使用的磺化石墨烯由以下方法制备而得：将氧化石墨烯固体分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系。往氧化石墨烯的分散体系加入5 wt %碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9~10，再加入30 mL浓度为0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌1小时，8000转/分钟离心水洗，得到中性的部分还原氧化石墨烯；将部分还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到部分还原氧化石墨烯悬浮液，然后加入对氨基苯磺酸重氮盐，混匀后在冰浴条件下搅拌2小时，离心双蒸水洗涤沉淀至其pH为7，得到呈中性的耦合物；将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5 wt %碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体。

磺化石墨烯对6-羧基荧光素标记单链DNA的荧光猝灭率为98.0%。

将40 μL 500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA与40 μL目标链DNA加入到405 μL 浓度为10 mmol/L的pH为8.0且含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA的Tris-HCl缓冲液中，37 ℃条件下杂交30分钟，加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度，激发波长为494 nm。

目标链DNA检测线性范围为0.2~40 nmol/L，检测限为12.36 pmol/L。

具体地说，本发明本发明所述的基于磺化石墨烯的DNA荧光检测方法，包括如下步骤：

（一）氧化石墨烯的制备

称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0 ℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35 ℃温水浴中，控温1小时，然后再将混悬液转移至50 ℃温水浴中，控温12小时。将一定量的冰水混合物缓慢加入到得到的紫黑色混悬液中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30% 过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000 转/分钟离心30分钟，分别经过水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨烯固体。

（二）磺化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的制备

将步骤（一）制得的氧化石墨烯固体分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系。往氧化石墨烯的分散体系加入5%碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9~10，再加入30 mL浓度为0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌1小时，8000转/分钟离心水洗，得到中性的部分还原氧化石墨烯。将部分还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到部分还原氧化石墨烯悬浮液，然后加入对氨基苯磺酸重氮盐，混匀后在冰浴条件下搅拌2小时，离心双蒸水洗涤沉淀至其pH为7，得到呈中性的耦合物。将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5%碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在一定温度下进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体。

（三）DNA检测

将40 μL浓度为500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）与40 μL不同浓度目标链DNA加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液中（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA），混合均匀，在37 ℃条件下杂交30分钟。然后加入15 μL浓度为50 μg/mL的磺化石墨烯，反应 30秒，用荧光分光光度计检测荧光（激发波长494 nm）。

为了实现上述试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是包括a液和b液；a液为磺化石墨烯溶液，b液为含探针链FAM-ssDNA的Tris-HCl缓冲液。

a液为浓度为50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

b液为含44.94 nmol/L探针链FAM-ssDNA的10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述的Tris-HCl缓冲液其pH为8.0，且含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA。

具体地说，本发明所述的基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，具有如下特征：

（四）试剂盒组成

a液包括上述技术方案（二）制备的磺化石墨烯加入超纯水超声分散所形成的溶液，其浓度为50 μg/mL。b液为含44.94 nmol/L探针链DNA的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA）。

本发明所述的一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法为：40 μL目标链DNA加入到445 μL b液中，混合后在37 ℃条件下杂交反应30分钟，在混合溶液中加入15 μL a液，混合后室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度F，激发波长为494 nm。

目标链DNA检测线性范围为0.2~40 nmol/L，检测限为12.36 pmol/L。

所述的一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法，能区分单碱基错配DNA和目标链DNA。

具体地说，所述的一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法具有如下特征：

（五）试剂盒使用方法

将目标链DNA 40 μL 加入到445 μL技术方案（四）的b液，混合后37 ℃杂交30分钟。加入15 μL技术方案（四）的a液，混合后室温条件下反应30秒，立即用494 nm激发波长检测其520 nm处荧光强度（F）。以F（含有目标链DNA）与F₀（空白）的差值（F- F₀）对目标链DNA绘制标准曲线进行定量。荧光分光光度法测定的检测限为12.36 pmol/L。

本发明的优点：

（1）本发明使用磺化石墨烯为探针，具有吸附单链DNA能力强、用量少、反应迅速等特点。

（2）本发明使用的磺化石墨烯纳米材料其本身具有良好的水溶性，荧光背景低等性质，不需要任何前修饰步骤。

（3）本发明在检测DNA中测定灵敏度高，DNA检测限为12.36 pmol/L。

（4）本发明检测DNA选择性好，能有效区分单碱基错配和非互补DNA序列。

附图说明

图1为氧化石墨烯、磺化石墨烯与FAM-ssDNA作用的荧光光谱图。

图2为磺化石墨烯对FAM-ssDNA的猝灭动力学曲线。

图3为检测不同浓度目标DNA时的荧光光谱图。

图4为目标DNA的标准曲线。

图5为DNA检测特异性图。

具体实施方式

本发明的一个方面在于提供一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测方法。以下结合附图及若干实施例对本发明检测方法的技术方案作进一步的说明。

实例1：

称取325目鳞片石墨2.7 g，加入到316 mL浓度为18.4 mol/L的浓硫酸和36 mL浓度为14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0 ℃冰浴中。将16.2 g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35 ℃温水浴中，控温1小时，然后将所得墨绿混悬液转移至50 ℃温水浴中，控温12小时得到紫黑色混悬液混合物。360 mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，搅拌30 分钟。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180 mL 超纯水充分振荡洗涤，4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入180 mL 30wt% 盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

实例2：

在装有冷凝管、搅拌器、滴液漏斗和温度计的150 mL四颈瓶中放入10 mL 5 wt%碳酸钠溶液及2.1 g对氨基苯磺酸晶体，搅拌下温热使其溶解，再加入0.8 g亚硝酸钠与6 mL水配成的溶液，用冰浴冷至0~5 ℃。在不断搅拌下，将3 mL浓盐酸与10 mL水配成的溶液滴入上述混合溶液中，在冰浴中继续搅拌15 min，得到对氨基苯磺酸重氮盐。

实例3：

将实施例1制得的氧化石墨烯固体分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系。往氧化石墨烯的分散体系加入5 wt %碳酸钠溶液，以使得氧化石墨烯的分散体系的pH值为9~10，再加入30 mL浓度为0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌1小时，8000转/分钟离心水洗，得到中性的部分还原氧化石墨烯。将部分还原氧化石墨烯分散于75 mL去离子水中，得到部分还原氧化石墨烯悬浮液，然后加入实例2制得的对氨基苯磺酸重氮盐，混匀后在冰浴条件下搅拌2小时，离心双蒸水洗涤沉淀至其pH为7，得到呈中性的耦合物。将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5 wt %碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在60 ℃下进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体。

实例4：

在445 μL 浓度为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL浓度为500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL浓度为50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室温反应30秒，测定荧光光谱（激发波长494 nm）。由图1可知，磺化石墨烯的荧光猝灭率为98.0%，显著高于氧化石墨烯的15.6%。

实例5：

在445 μL 浓度为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL浓度为500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL浓度为50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室温反应0~120秒，测定520 nm处的荧光强度（激发波长494 nm）。由图2可知，磺化石墨烯可在30秒内猝灭FAM-ssDNA的荧光。

实例6：

将40 μL 500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）与40 μL不同浓度目标链DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃条件下杂交30分钟。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室温反应30秒，用荧光分光光度计检测荧光光谱（激发波长494 nm）。如图3所示，荧光强度随着目标链DNA浓度的增大而增大。

实例7：

将40 μL 500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）与40 μL不同浓度目标链DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃条件下杂交30分钟。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度（激发波长494 nm）。如图4所示，目标链检测线性范围为0.2~40 nmol/L，检测限为12.36 pmol/L。

实例8：

将40 μL 500 nmol/L 6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）与40 μL 500 nmol/L目标链DNA或单碱基错配链DNA（Takara Bio）或非互补链DNA（Takara Bio），加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃条件下杂交30分钟。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度（激发波长494 nm）。如图5所示，该检测方法具有良好的特异性，可区分目标链与单碱基错配链，单碱基错配链荧光恢复仅相当于目标链的27.8%。

本发明的另一个目的在于提供一种基于磺化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供磺化石墨烯（a液），含探针链DNA（FAM-ssDNA）的Tris-HCl缓冲液（b液）。

实例9：

a液的制备：称取5 mg上述实例2制备所得磺化石墨烯，加入10 mL超纯水，超声5小时，得到浓度为50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

实例10：

b液的制备：将40 μL 500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶解于405 μL浓度为10 mmol/L 的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA），得到浓度为44.94 nmol/L的FAM-ssDNA。

实例11：

试剂盒使用方法：40 μL目标链DNA（Takara Bio）分别加入到445 μL实施例10制备的b液，混合后在37 ℃条件下杂交反应30分钟。然后，在混合溶液中加入15 μL实施例9制备的a液，混合后室温反应30秒，测定520 nm处的荧光强度F（激发波长494 nm）。根据F（含有目标链DNA）与F₀（空白）的差值（F- F₀）对目标链浓度绘制标准曲线，在0.2~40 nmol/L 范围内F-F₀与目标链DNA浓度呈线性关系，检测限为12.36 pmol/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。