高脂血症风险关联基因多态性检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，应用于基因遗传风险评估，具体地说是一种能够从基因水平评估高脂血症患病风险的高脂血症风险关联基因多态性检测方法。

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背景技术：
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随着人们生活水平的不断提高，日常膳食结构有了很大变化，与营养失衡相关的慢性疾病逐渐成为我国居民死亡的主要疾病，特别是心脑血管疾病，心脑血管疾病主要由动脉粥样硬化引起，而高脂血症(hyperlipidemia；HLP)则是导致动脉粥样硬化的首要危险因素，高脂血症的发病受遗传和环境等多因素影响。现有研究发现多个基因与血脂代谢相关，APOE(载脂蛋白E)基因上的C112R位点多态性(rs429358)和R158C位点多态性(rs7412)、LPL(脂蛋白脂酶)基因HindⅢ位点多态性(rs320)和MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)基因C677T位点多态性(rs1801133)与HLP密切相关，其多态性检测可作为受检者患高脂血症风险的预测依据。

APOE(载脂蛋白E)参与乳糜微粒和中间密度脂蛋白代谢。APOE基因主要有三个等位基因APOE2、APOE3和APOE4，这三种等位基因的差别在于第112位和第158位氨基酸残基是半胱氨酸还是精氨酸。APOE4基因相比于APOE3和APOE2对胆固醇有更好的代谢能力，而APOE2的蛋白代谢胆固醇的效率是这三种等位基因中最低的，所以APOE2纯合子的人患血管疾病和Ⅲ型高脂血症的概率要远高于其他人。因此检测APOE基因型可以预测患高脂血症的风险。

LPL(脂蛋白脂酶)是血浆甘油三脂代谢的限速酶，在脂质代谢中发挥极其重要的作用，有研究表明LPL基因内含子8区的HindⅢ酶切位点多态性与高脂血症的发生密切相关，是由495位的T突变为G引起的HindⅢ酶切位点缺失导致，将无HindⅢ酶切位点定义为H^-，有HindⅢ酶切位点定义为H⁺，目前的研究表明，跟H^-等位基因相比，H⁺等位基因与低LPL活性有关，即LPL Hind Ⅲ酶切位点T等位基因是高脂血症的风险因子。

MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)编码叶酸代谢通路中的关键酶，把同型半胱氨酸(HCY)甲基化为甲硫氨酸，MTHFR基因在677位点上的C突变为T导致其编码酶活性的降低，抑制HCY转化为甲硫氨酸，导致高HCY血症和低甲硫氨酸血症，而HCY水平的升高是导致高脂血症重要、独立的危险因素。

鉴于APOE、LPL和MTHFR基因在血脂代谢过程中的重要作用，将上述基因多态性作为易感因素来筛查易患高脂血症的人群，尽早采取预防措施，对于降低高脂血症的发病率具有重要意义。

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技术实现要素：
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本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种高脂血症风险关联基因多态性检测方法，能够将前述基因多态性作为易感因素来筛查易患高脂血症的人群，进而可尽早采取预防措施，降低高脂血症的发病率。

为实现上述目的设计一种高脂血症风险关联基因多态性检测方法，包括以下步骤：

1)提取DNA模板。采用DNA提取试剂盒抽提DNA，该试剂盒包括：检测APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)以及MTHFR基因上C677T(rs1801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物及测序引物；

2)PCR扩增反应。使用试剂盒中的PCR反应体系，该PCR反应体系包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR buffer和ddH₂O；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃最后延伸10min，保存于4℃；

3)PCR扩增产物纯化。使用试剂盒中的PCR产物纯化体系，该PCR产物纯化体系包括SAP酶、Exo I酶和ddH₂O；在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃15min，72℃20min；

4)DNA测序。测序反应体系包含PCR纯化产物、25％BigDye mix、3.2uM DNA测序引物、去离子水；在PCR扩增仪上进行反应：98℃2min，进行25个循环的96℃30秒，55℃30秒，60℃4min；反应结束后加入125mM EDTA溶液和100％乙醇溶液于室温下沉淀15min；在4℃下，3600rpm/min离心30min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇溶液，3600rpm/min离心15min，倒去上清液，室温放置20min后，加入HIDI溶液，放入测序仪中；

5)基因型分析：通过测序图谱即可直接读出SNP位点基因型。

进一步地，步骤2)中，PCR反应体系的体积以25μL计，其组分及含量为：5×PCR buffer5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，2.5mM dNTP混合液2μL，ddH₂O 10.75μL，10μM上下游引物各2.5μL，DNA模板2μL。

进一步地，步骤2)中，APOE基因上C112R和R158C的退火温度为63℃，LPL基因上HindⅢ的退火温度为57℃，MTHFR基因上C677T的退火温度为57℃。

进一步地，步骤3)中，PCR产物纯化体系的体积以25μL计，其组分及含量为：20μLPCR产物，1U/μL SAP酶0.75μL，10U/μL Exo I酶0.375U/μL，ddH₂O 3.875μL。

进一步地，步骤4)中，测序反应体系的总体积以5μL计，其组分及含量为：PCR纯化产物1μL、25％BigDye mix1μL，3.2uM DNA测序引物1μL，去离子水2μL，125mM EDTA溶液1μL，100％乙醇溶液15μL，70％乙醇溶液30μL，HIDI溶液8μL。

进一步地，步骤4)中，各基因测序引物为：

APOE(C112R/R158C)：5′-CACTGTGCGACACCCTCCCC-3′；

LPL(HindⅢ)：5′-TCATTTGGCACTGTTTCTTGC-3′；

MTHFR(C677T)：5′-TCAAGGCAGGACAGTGTGGGAGTTC-3′。

本发明同现有技术相比，提供了一种高脂血症风险关联基因多态性检测方法，该方法首先采用DNA提取试剂盒抽提DNA，试剂盒包括检测APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)和MTHFR上C677T(rs1801133)的4个单核苷酸多态性(SNP)位点基因型的特异性引物及测序引物，同时使用试剂盒中的PCR反应体系、PCR产物纯化体系、DNA测序体系，以及配合使用各体系合理的组分和含量，最终通过测序图谱直接读出SNP位点基因型，根据检测结果，结合APOE、LPL和MTHFR基因在血脂代谢过程中的作用，将上述基因多态性作为易感因素来筛查易患高脂血症的人群，进而可尽早采取预防措施，降低高脂血症的发病率。

[附图说明]

图1是本发明实施例APOE基因上(C112R)的检测结果示意图；

图2是本发明实施例APOE基因上(R158C)的检测结果示意图。

[具体实施方式]

本发明提供了一种高脂血症风险关联基因多态性检测方法，方法中所使用到的DNA提取试剂盒包括：检测APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)和MTHFR上C677T(rs1801133)的4个单核苷酸多态性(SNP)位点基因型的特异性引物及测序引物。试剂盒中的PCR反应体系、PCR产物纯化体系、DNA测序体系分别为：PCR反应体系包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR buffer和ddH₂O等；PCR产物纯化体系包括SAP酶、Exo I酶和ddH₂O等；DNA测序体系包括Big Dye Mix、EDTA溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、HIDI溶液和ddH₂O等。

该试剂盒的具体组分和含量为：25μLPCR反应体系：5×PCR buffer 5μL；5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL；2.5mM dNTP混合液2μL；ddH₂O 10.75μL；10μM上下游引物各2.5μL；DNA模板2μL。25μLPCR纯化体系：20μLPCR产物；1U/μL SAP酶0.75μL；10U/μL Exo I酶0.375U/μL；ddH₂O 3.875μL。测序反应体系：25％BigDye mix 1μL；3.2μM DNA测序引物1μL；125mM EDTA溶液1μL；100％的乙醇溶液15μL；70％乙醇溶液30μL；HIDI溶液8μL；ddH₂O 2μL。

下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：

1.提取DNA模板

刮取口腔黏膜上皮细胞，用康为DNA提取试剂盒抽提DNA。

2.PCR扩增反应

使用试剂盒中PCR反应组件，其中各基因引物序列分别如下表：

PCR反应体系：5×PCR buffer 5μL；5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL；2.5mM dNTP混合液2μL；ddH₂O 10.75μL；10μM上下游引物各2.5μL；DNA模板2μL。

反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30秒，退火30秒(不同基因按相应的退火温度)，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃最后延伸10min，保存于4℃。

3.PCR扩增产物纯化

使用试剂盒中的PCR产物纯化组件：20μLPCR产物；1U/μL SAP酶0.75μL；10U/μL Exo I酶0.375U/μL；ddH₂O 3.875μL。

在PCR扩增仪上进行反应：反应条件为37℃15min，72℃20min。

4.DNA测序：

各基因测序引物如下：

APOE(C112R/R158C)：5′-CACTGTGCGACACCCTCCCC-3′

LPL(HindⅢ)：5′-TCATTTGGCACTGTTTCTTGC-3′

MTHFR(C677T)：5′-TCAAGGCAGGACAGTGTGGGAGTTC-3′

反应的体系为总体积5μL，包含PCR纯化产物1μL，25％BigDye mix1μL，3.2uM DNA测序引物1μL，去离子水2μL。

在PCR扩增仪上进行反应：98℃2min,进行25个循环的96℃30秒，55℃30秒，60℃4min。

反应结束后加入125mM EDTA溶液1μL和100％乙醇溶液15μL于室温下沉淀15min；在4℃下，3600rpm/min离心30min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇溶液30μL，3600rpm/min离心15min，倒去上清液，室温放置20min后，加入HIDI溶液8μL，放入测序仪中。

5.基因型分析

通过测序图谱可直接读出SNP位点基因型。例如对APOE(C112R/R158C)的检测结果如附图1和附图2所示，其中，附图1是C112R(466T>C)示意图，附图2是R158C(604C>T)示意图，由于112和158位点均未发生突变，故该检测者携带APOE3等位基因，无患老年痴呆风险。

本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。