c-kit基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] c-kit基因位于人染色体4ql2_13,属于原癌基因，其产物是III型酪氨酸激酶，是 酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，其作为干细胞因子的受体，可以通过一系列信 号通路参与造血干细胞增殖分化的调控。近年来研究发现，c-kit基因存在突变，突变主 要在第9、11、13、17外显子。c-kit基因的突变与胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST)及急性髓系白血病（AML)的发病、治疗和预后等密切相关。研究还证实c-kit 基因的继发突变，即在原有突变的基础上，出现新的位点的突变，如c-kit基因第13和17 外显子的突变，改变c-kit蛋白的第一和第二个激酶结构域，影响伊马替尼的结合，是导 致伊马替尼耐药的主要原因。
[0003] 有数据显示，在AML中c-kit基因突变的频率为8. 0%，其中c. 2446G>C占4. 8%， c. 2446G>T占9. 2%，c2447A>T占38. 6%。目前c-kit的检测方法主要有液相芯片技术和 测序等。费时费力且花费大，目前尚无有效而经济的检测产品。因此，开发一种检测c-kit 基因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的c-kit基因多态性检测是 非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的c-kit基因多态性检测 试剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0005] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种c-kit基因多态性检测 引物，包括针对c-kit基因c. 2446位点为G情况的正向引物，针对c-kit基因c. 2446位点 为C情况的正向引物，针对c-kit基因c. 2446位点为T情况的正向引物，针对c-kit基因 c. 2447位点为A情况的正向引物，针对c-kit基因c. 2447位点为T情况的正向引物，对应 c-kit基因c. 2446位点和c. 2447位点的反向通用引物，检测0 -actin基因的正向引物，以 及检测0 -actin基因的反向引物；所述针对c-kit基因c. 2446位点为G情况的正向引物 的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对c-kit基因c. 2446位点为C情况的正向引物 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述针对c-kit基因c. 2446位点为T情况的正向引物 的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述针对c-kit基因c. 2447位点为A情况的正向引物 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述针对c-kit基因c. 2447位点为T情况的正向引物 的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述对应c-kit基因c. 2446和c. 2447位点的反向通 用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述检测P-actin基因的正向引物的核苷酸序 列如SEQ ID No. 7所示；所述检测f3-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8 所示。
[0006] 各引物应用于PCR反应体系中的终浓度为0. 4 yM。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 c-kit基因多态性检测试剂盒。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种c-kit基因多态性检测 体系，包括用于检测c-kit基因c. 2446位点为G情况的PCR反应体系A，用于检测c-kit 基因c. 2446位点为C情况的PCR反应体系B，用于检测c-kit基因c. 2446位点为T情况 的PCR反应体系C，用于检测c-kit基因c. 2447位点为A情况的PCR反应体系D，用于检测 c-kit基因c. 2447位点为T情况的PCR反应体系E，以及用于检测-actin基因作为内对 照的PCR反应体系F ;所述PCR反应体系A包括针对c-kit基因c. 2446位点为G情况的正 向引物、对应c-kit基因c. 2446位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所 述PCR反应体系B包括针对c-kit基因c. 2446位点为C情况的正向引物、对应c-kit基因 c. 2446位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系C包括针 对c-kit基因c. 2446位点为T情况的正向引物、对应c-kit基因c. 2446位点的反向通用 引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系D包括针对c-kit基因c. 2447位 点为A情况的正向引物、对应c-kit基因c. 2447位点的反向通用引物、SYBR Green混合液 和DNA模板；所述PCR反应体系E包括针对c-kit基因c. 2447位点为T情况的正向引物、 对应c-kit基因c. 2447位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反 应体系F包括检测0-actin基因的正向引物、检测0-actin基因的反向引物、SYBR Green 混合液和DNA模板；所述针对c-kit基因c. 2446位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示；所述针对c-kit基因c. 2446位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 2所示；所述针对c-kit基因c. 2446位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 3所示；所述针对c-kit基因c. 2447位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 4所示；所述针对c-kit基因c. 2447位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No. 5所示；所述对应c-kit基因c. 2446位点和c. 2447位点的反向通用引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述检测f3-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述检测0 -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示。
[0009] 各PCR反应体系的体积为10 y 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 y 1，各 引物的终浓度为0. 4 yM，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ y 1，其余为纯水。
[0010] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的c-kit基因多态性检测试剂盒。
[0011] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 结果判定方法，具体步骤如下：
[0012] 第一步，采用PCR反应体系F检测样本的0-actin基因，
[0013] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0014] 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0015] 第二步，采用PCR反应体系A、B和C分别检测该样本的c. 2446位点的情况；
[0016] 若三个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则排除三者中最大的CT值数 据，对另外两个反应体系扩增的CT值进行判断：当两者CT差值的绝对值< 2时，样本判断 为这两者的杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应 的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制 备样本进行检测；
[0017] 若三个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测；
[0018] 第三步，采用PCR反应体系D和E分别检测该样本的c. 2447位点的情况；
[0019] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内：当两者CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0020] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测。
[0021 ] 本发明具有积极的效果：
[0022] (1)本发明的c-kit基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的荧光检测策略应用于检测人c-kit基因c. 2446位点和c. 2447位点的多态性，筛选 优化引物并确定该方法下的方便准确的判断依据，具有检测快速方便，灵敏度高，准确率高 的特点，适合批量检测，应用范围极广。
[0023] (2)本发明的c-kit基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。
[0024] (3)本发明的c-kit基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 c-kit基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。
【附图说明】
[0025] 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的c-kit基因c. 2446位点的扩增曲线；
[0026] 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的c-kit基因c. 2446位点的扩增曲线；
[0027] 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的c-kit基因c. 2447位点的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具