As-pcr引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸诊断试剂领域，具体设及一种改进的等位基因特异性聚合酶链式 反应(AS-PCR)引物设计方法。本发明还设及一种改进的AS-PCR基因多态性检测方法及试剂 盒，所述方法及试剂盒用于对可能（即怀疑)包含等位基因变异区域的祀序列进行检测W确 定等位基因变体是否存在。
【背景技术】
[0002] 等位基因特异性寡核巧酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)是基 于杂交的突变检测技术，常用W检测已知突变。设计一段例如15~20bp的寡核巧酸片段，其 中包含了发生已知突变的部位，W此为探针，当与固定在膜上的样品DNA杂交时，由于一个 碱基的差异会导致Tm值下降5~7.5°C，因此通过严格控制杂交条件，可W鉴定出样品DNA中 是否存在突变。
[0003] 将AS0与PCR相结合的等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)是目前一种常用 于分析基因多态性，特别是单核巧酸多态性(SNP)的方法。多态性(polymor地ism)是指在一 个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基 因（allele)，亦称遗传多态性(genetic polymor曲ism)或基因多态性。从本质上来讲，多态 性产生于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功 能的区域。单核巧酸多态性(SNP)，即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失、插入和 置换，其中W单个碱基置换的情形居多。SNP是目前倍受关注的一类多态性，由于其经常在 遗传疾病、疾病易感性、药物不良反应性等研究中具有遗传标记的作用，因此，其检测为疾 病诊断和早期诊断，药物学研究等提供了巨大的潜在可能。
[0004] 在AS-PCR中，PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点处退火，使 其能够区分同一基因的不同等位基因，运些等位基因类型包括碱基的替换、插入和缺失。 AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度:相比于3 '端最后一个碱基正确匹配引物而言，3 '端最后 一个碱基错配的引物在延伸效率上大大降低(通常为1/100至1/1〇〇,〇〇〇)。3'端最后一个碱 基错配的引物由此导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突变。
[0005] 传统AS-PCR的引物3 '端最后一个碱基特别关键，必须为基因多态性位点。W检测 SNP为例，其原理如图1所示。图1A中，针对包含SNP位点的祀序列设计等位基因特异性引物 (下称AS引物）1 -1、1 -2，即，在常规PCR引物设计基础上，使待iiSNP位点恰好位于AS引物1 -1、1-2的3'末端，即引物1-1与1-2仅3'末端的碱基不同（分别对应野生型和可能的突变型）， 其余碱基序列一致，其中5 '端X代表碱基上的径基或憐酸基，3 '端Y代表碱基上的径基。图1B 中，2-1和2-2分别为等位基因所在的野生型和突变型DNA双链，其中2-化和2-化分别为与AS 引物配对的模板链。如图1C所示，按照3'端最后一个碱基严格互补配对的原理，实现等位基 因的特异性扩增。也就是说，若图1A中的AS引物与图1B中的模板完全互补配对，则形成图1C 中3-U3-2所示双链结构，PCR反应顺利进行，若形成图1C中3-3、3-4所示情况，3'末端碱基 错配，贝化CR反应不可进行。通过分析PCR扩增结果，判定SNP情况，若引物1-2扩增而引物1-1 无明显扩增，则表明存在所述突变。
[0006] 传统AS-PCR对DNA聚合酶的要求比较高。PCR(非AS-PCR)反应体系中常用的DNA聚 合酶有A型和B型两种，A型DNA聚合酶具有5 '端到3 '端的DNA聚合酶活性，如化q DNA聚合酶 等;B型DNA聚合酶不但具有5 '端到3 '端的DNA聚合酶活性，还具有3 '端到5 '端的DNA外切酶 活性，可W即时识别并切除3'端的错配碱基（因错配导致翅起），从而剩下未错配的碱基得 W继续扩增，例如pfu DNA聚合酶、K0D DNA聚合酶，等等。由于传统AS-PCR正需要利用多态 性位点的错配引物，故而扩增反应中仅能使用A型DNA聚合酶，不能使用会将错配碱基切除 的B型DNA聚合酶。
[0007] 图2A和2B示意性地示出了 A型和B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况。其 中，图2A是A型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况，当引物(3'端为径基)与模板完全匹 配时，在A型DNA聚合酶作用下引物得W扩增（左），而当引物3'端与模板错配时，退火溫度下 错配部分翅起，不能与模板结合，A型DNA聚合酶不起作用，引物不能扩增(右），利用此特性， 传统AS-PCR得W实现等位基因多态性的检测；图2B是B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作 用情况，当引物与模板完全匹配时，在B型DNA聚合酶作用下引物得W扩增(左），而当引物3' 端与模板错配时，错配部分翅起，B型DNA聚合酶先发挥3 '端到5 '端的DNA外切酶作用，将错 配部分切除，剩下未错配的引物在DNA聚合酶作用下得W继续扩增(右），运样显然无法用于 传统AS-PCR中鉴别等位基因多态性。
[000引传统AS-PCR技术存在W下缺点：
[0009] 第一、由于AS引物要针对待测突变型进行设计，故而传统AS-PCR技术仅能对已知 的多态性位点进行检测，不能检测未知的突变类型。
[0010] 第二、传统AS-PCR技术在检测扩增结果方面，一种是采用电泳分析方法，运种方式 操作复杂费时，成本高，且技术较难普及;另一种是采用实时巧光定量PCR，运也需要额外合 成标记有巧光基团和巧光巧灭基团的巧光探针。
[0011] 因此，业界存在改良传统AS-PCR技术的需要。在属于同一权利人的中国发明专利 化201410106312.0中，提出了一种新的AS-PCR技术，其中对AS-PCR引物进行修饰，使所述 AS-PCR引物的3 '端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团，并且使用 B型DNA聚合酶进行的PCR反应，使得所述经修饰的AS-PCR引物在与模板链错配时延伸，而与 模板链互补时不延伸。
[001引由于上述设计的AS-PCR引物3'端具有能够屏蔽引物直接延伸的基团，当与模板 DNA结合时，若引物与模板完全互补，由于引物的3 '进行了去径基化修饰，无法与dNTP发生 聚合反应，因此引物不延伸。反之，若引物与模板错配，即不完全互补，则退火时错配部分翅 起不与模板结合，此时B型DNA聚合酶的3'端到5'端外切酶活性起作用，将引物3'端翅起的 不互补配对的部分切除，剩余引物部分的3'端径基露出（DNA链上dNTP之间的憐酸二醋键在 B型DNA聚合酶作用下水解后，引物3 '端产生径基，水解下的dNTP或DNA链的5 '端形成憐酸 基），如此，酶切后的引物即可在DNA聚合酶作用下延伸。
[001引图3A和3B示意性地示出了 B型DNA聚合酶在上述AS-PCR体系中的作用原理。图3A中 引物3'端连接有屏蔽引物延伸的基团Y'，图3B中引物5'端连接有巧光基团X0,3'端连接有 泽灭基团Υο。当引物与模板完全匹配时，由于3'端径基被屏蔽，引物无法扩增（左），而当引 物3 '端碱基与模板错配时，退火溫度下错配部分翅起，Β型DNA聚合酶先发挥3 '端到5 '端的 DM外切酶作用，将错配部分切除，剩下未错配的引物在DM聚合酶作用下得W继续扩增 (右)。
[0014] 因此，与传统AS-PC时目反，上述AS-PCR引物只有在错配时才延伸，而与模板链互补 时则不延伸，运样就可W不区分突变类型而检测等位基因多态性是否存在。具体而言，如果 某一等位基因存在多种可能的突变，例如单个或多个碱基插入、缺失或替换，而人们仅需要 检测样品是否存在突变而不必确定具体的突变类型时，则可W仅针对野生型设计AS-PCR引 物，若扩增表明样品存在突变，反之不扩增表明样品为野生型。较之传统AS-PCR引物，其在 与模板链互补时延伸而发生错配则不延伸，故要针对每一种突变设计引物，运种新方法的 优点显而易见。
[0015] 随着碱基标记技术的进步，目前在引物序列任何位置标记巧光基团或者泽灭基团 都是容易实现的，例如生工生物、Thermoscientific都有此类服务。所W本发明人在上一个 专利基础上进行了进一步研发，获得了一种新的AS-PCR引物设计方法，该方法针对祀序列 的等位基因变异区域(包括SNPW及一个或多个碱基插入或缺失)来设计引物，用W确定该 等位基因变异区域的具体类型。该方法不但提供了一种不同于化201410106312.0技术的替 代方案，而且在B型DNA聚合酶为3'径基依赖型的情况下仍然可W正常发挥作用（由于 化201410106312.0技术中引物的3 '进行了去径基化修饰，3 '径基依赖型B型DNA聚合酶可能 不发挥作用）。因而从DNA聚合酶的适用范围而言，本发明的方法比化201410106312.0技术 更有应用优势。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的和优点一部分将在下面的描述中列出，另一部分对于本领域普通技 术人员来说容易基于下面的描述而想到。
[0017] 本发明的一个目的是提供一种AS-PCR引物的设计方法，所述方法包括W下步骤： (i)针对包含待测等位基因变异区域的祀序列设计AS-PCR引物；（ii)对步骤（i)所设计的 AS-PCR引物进行修饰，在引物5'端1~8个碱基内标记一巧光基团，对等位基因变异区域的 碱基用泽灭基团标记；（iii)在步骤（ii)所设计的AS-PCR引物3'端额外合成1~3个与待测 基因不互补的碱基。利用本发明上述方法设计的引物可用于确定待测等位基因是否与已知 基因类型不同的AS-PCR反应，例如用于区分野生