一种cyp2d6_c100t基因多态性的引物及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种CYP2D6_C100T基因多态性的引物及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22号染色体上， 其含有9个外显子和8个内含子，总长为化b左右，是一个完整的功能性基因。有研究发现， CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P 基因与CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性，而且带有TATA盒，但是由于在外显子1的第226 位点上插入了一个胸腺喀晚(T)，从而改变了读码框架，使转录提前终止;CYP2D8P基因是一 个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达，只有 CYP2D6在肝、肠、肾和人脑中表达。
[0003] 现代研究发现，肝脏中CYP2D6的含量仅占 P450肝脏蛋白总量的2%，但是，它却参与 代谢约25%的临床用药，包括抗抑郁药、抗屯、律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现 超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要是单核巧酸变异、大片段基因的丢失W及多基因拷 贝，运些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其代谢表型的多样性，使酶的活性表现为缺 失、降低、正常或是增加等几种类型。
[0004] 杨软等人发表了一篇题目为"CYP2D6基因多态性与他莫昔芬治疗"的论文，该论文 表明不同基因型的CYP2D6对他莫昔芬的代谢不同，产生的活性代谢产物(4-径基他莫昔芬 和化doxifen)浓度不同，其中PMs(含两个无效等位基因致CYP2D6活性缺失）血浆中活性 代谢产物浓度最低，而UMs(含两个W上正常功能等位基因，即多基因拷贝致CYP2D6活性增 强)血浆活性代谢产物浓度最高。因此，CYP2D6的多态性研究对临床具有重要的意义，成为 目前研究的热点。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种CYP2D6_C100T基因多态性的引物 及其检测方法，该引物检测CYP2D6基因 C100T (rsl065852)位点，具有特异性好、灵敏度高、 准确性高等优点，为CYP2D6_C100T基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
[0006] 本发明提供了一种CYP2D6_C100T基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和 SNaPshot PCR引物;所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引 物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5 ' - CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 ' (沈Q ID N0.1)和下游引物5'- CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3'（沈Q ID 側.2);所述巢式8轮 PCR扩增引物为：针对CYP2D6_C100T的上游引物5'-CAGAGGAGCCCATTTGGTAG -3'（SEQ ID N0.3)和下游引物5'-CCTGGTCGAAGCAGTATGGT-3'（SEQIDN0.4);所述SNaPshotPCR引物 为：针对CYP2D6_C100TSNaPshot PCR引物5'- ACGCTGGGCTGCACGCTAC-3'（SEQ ID N0.5)。
[0007] 另外，本发明还提供了一种CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，包括如下步骤： SI提取DM样品； S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对巢式A轮PCR扩增产物进 行纯化； S3W巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重 PCR扩增； S4采用权利要求1所述的挪aPshot PCR引物进行挪aPshot PCR扩增，对扩增产物进行 纯化； S5毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[000引进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[0009]进一步地，所述步骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶 段2:98°C 10s;阶段3:72°C 3min;阶段4:返回到阶段2,24个循环;阶段5:72°C 5min;阶段 6:25°C 保溫。
[0010]进一步地，所述步骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶 段2:98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C Imin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6: 72°C 5min;阶段7:25°C 保溫。
[0011] 进一步地，所述步骤S4中的挪aPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保溫。
[001引进一步地，所述步骤S5中采用GENEMAPP邸ID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0013] 除此之外，本发明提供的CYP2D6_C100T基因多态性的引物在制备检测CYP2D6_ C100T基因多态性试剂中的用途。
[0014] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有W下优势：本发明提供了一种 CYP2D6_C100T基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现 了CYP2D6_C100T基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降 低不良反应具有非常重要的意义。
【附图说明】
[001引图巧本发明提供的CYP2D6_C100T的扩增片段； 图2为CYP2D6_C100T引物扩增产物的部分测序图； 图3为样品的CYP2D6_C100T基因多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0017] 实施例一、引物 本发明提供的引物如表1所示，包括巢式PCR扩增引物和挪aPshot PCR引物;所述巢式 PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物，所述巢式B轮PCR扩增引物 和挪aPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无 已知SNP位点。
[0018] 表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,结果如下： CYP2D6_C100T基因特异引物于UCSC中进行Blast,无其它同源基因。CYP2D6_C100T扩增 片段位于C虹22:42130611-42130821，长度为21化P，扩增序列如图1。
[0019]使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显示， 各引物扩增片段与与CYP2D6_C100T基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中 SNaPshot PCR引物，S化Pshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位 置及测序反应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
[0020] 实施例S、CYP2D6_C100T基因多态性的检测 1)提取抓TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自 Τ iagen，货号DP318 )的说明书，将DM样品稀释至1 OOng/yL，备用。
[0021 ] 2)配制引物混合物：配制巢式A轮PCR引物混合物，CYP2D6-Fwd: CYP2D6-Rev:肥0= 1:1:3,引物终浓度为1 pmolAiL，震荡混匀，短暂离屯、后备用;配制B轮PCR引物混合物，引物 终浓度为0.5 pmol/μレ短暂离屯、后备用;PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购 自