肥B公司，货号M049化），反应体系如表2所示。A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:72°C 3min;阶段4:返回到阶段2,24个循环；阶段5:72°C 5min;阶段6:25°C保溫。巢式B轮PCRWA轮PCR产物为模板，巢式B轮PCR扩增反应条件包括： 阶段 1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C Imin;阶段5:返回到阶 段2,29个循环;阶段6:72°C5min;阶段7:25°C保溫。PCR扩增结束后，取2.0μLExoSAP-IT (购自Affymetrix，货号78205)和3. ΟμΙ dd出0，混匀，加入PCR扩增产物2. OyL，混匀微离屯、； 在PCR仪中进行酶切反应，程序:37°C，15 min; 80°C，15min; 4°C，保溫。
[0022] 表2、PCR试剂配制表格
3)配置SNaPshot PCR引物混合物，引物终浓度为0.8 pmol/yL，采用SNaPshot? Multiplex Kit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如表3所示。SP'JaPshot PCR反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段 1，25个循环;阶段5:4°C保溫。
[0023] 表3、SNaPshot试剂配制表格
在挪aPshot PCR产物中加入1.化L SAP酶，按照W下程序进行反应:37°C，15min; 80°C， 15min; 4°C，保溫。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GE肥MAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
[0024] 实施例四、检测CYP2D6_C100T基因多态性的方法的特异性 本发明方法的特异性定义为阴性符合率。本发明对22例样本进行优化挪aPshot测序法 检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。挪aPshot测序法检测出的阴性结果与Sanger 法显示的结果相符(见表4)。本发明的检测特异性为100%。
[00巧]表4、CYP2D6_C100T检测特异性试验数据
实施例五、检测CYP2D6_C100T基因多态性的方法的灵敏度 本发明方法的灵敏度定义为阳性符合率。本发明对22例样本进行优化挪aPshot测序法 检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。挪aPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger 法显示的结果相符(见表5)。本发明的检测灵敏度为100%。
[0026]表5、CYP2D6_C100T 检测灵敏度
实施例六、检测CYP2D6_C100T基因多态性的方法的准确度 本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对22例样本进行SNaPshot 巧贼法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。不同方法检测结果一致，如表6所示。 本发明的准确度为100%。
[0027] 表6、CYP2D6_C100T基因 SNPs位点检测准确度
实施例屯、检测CYP2D6_C100T基因多态性的方法的精密度 本发明的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。本发明进行了人员 间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比试验(见表7)，所有结果均显示一致，本 发明精密度为100%。
[0028]表7、批间精密度试验数据
w上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种CYP2D6_C100T基因多态性的引物，其特征在于：包括巢式PCR扩增引物和 SNaPshot PCR引物;所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引 物;所述巢式A轮扩增引物为:针对CYP2D6的上游引物5 ' - CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 '和 下游引物5 ' - CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3 ' ；所述巢式B轮PCR扩增引物为：针对CYP2D6_ C100T的上游引物5 ' -CAGAGGAGCCCATTTGGTAG -3 ' 和下游引物5 ' -CCTGGTCGAAGCAGTATGGT-3所述 SNaPshot PCR 弓| 物为：针对CYP 2 D6_C 1 0 0 T_SNaP s ho t PCR 弓|物5'-ACGCTGGGCTGCACGCTAC-3'。2. -种CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对A轮PCR扩增产物进行纯 化； S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重 PCR扩增； S4采用权利要求1所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行 纯化； S5毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。3. 根据权利要求2所述的CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤 S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。4. 根据权利要求2所述的CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤 S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:72°C 3min;阶段4:返回到阶段2,24个循环;阶段5:72°C 5min;阶段6:25°C保温。5. 根据权利要求2所述的CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤 S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括：阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保 温。6. 根据权利要求2所述的CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤 S4中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1:96°C 10s;阶段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。7. 根据权利要求2所述的CYP2D6_C100T基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤 S5中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。8. 根据权利要求1所述的CYP2D6_C100T基因多态性的引物在制备检测CYP2D6_C100T基 因多态性试剂中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种CYP2D6_C100T基因多态性的引物及其检测方法。本发明提供的CYP2D6_C100T基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物。本发明提供的CYP2D6_C100T基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了CYP2D6_C100T基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降低不良反应具有非常重要的意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506092
【申请号】CN201511006948
【发明人】胡昌明, 梁耀铭, 于世辉, 赵薇薇, 燕启江, 罗锦霞
【申请人】广州金域检测科技股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月30日