致肝脓肿肺炎克雷伯菌特异性基因序列asnC及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学疾病诊断和治疗药物选择领域，具体设及致肝脈肿肺炎克雷伯菌 基因特异性序列asnC及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯菌化.pneumoniae subsp.pneumonia)，属于肠杆菌科细菌，革兰染色 阴性，有较厚的芙膜，多数有菌毛，无芽抱和鞭毛，寄生于人体皮肤、鼻咽部和肠道等处，可 引起严重的肺炎、尿路感染和血流感染等，是临床上常见的条件致病菌化i B，Zhao Y，Liu C,Chen Z,Zhou D.Molecular pathogenesis of Klebsiella pneumoniae .Future Microbiol，201 4;9(9):1071-81)。
[0003] 肝脈肿化iver Abscess, LA)是发生于肝脏的一种继发性感染性疾病，可W由细 菌、真菌、寄生虫等引起，感染病变中屯、液化坏死、组织溶解、肉芽组织覆盖并形成脈腔，是 常见的消化系统严重疾病。20世纪70年代W前，细菌性肝脈肿主要由W大肠埃希菌为主，当 时非手术治疗肝脈肿的死亡率高达83%，手术治疗的死亡率高达28%，促成高死亡率的主 要原因是诊断和治疗的不及时（Valles J,C.Leon , Alvar ez-Lerma .Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multi-center study evaluating epidemiology and prognosis.Clin Infe ct Dis,1997,24:387-395)。1986年，台湾Liu等 人首次报道了由肺炎克雷伯菌导致的肝脈肿病例7例化iu Υ，化eng D，Lin C.Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis.Arch Intern Med 1986; 146:1913-16)。随后肺炎克雷伯菌肝脈肿在东亚地区开始流行，包括：中国、新加 坡、香港、韩国和越南等。1999年，美国出现肺炎克雷伯菌肝脈肿病例并开始流行(Saccente Μ.Klebsiella pneumoniae liver abscess,endoph thalmitis,and meningitis in a man with newly recognized diabetes mellitus.Clin Infect Dis.1999；29(6):1570-l.);2012年欧洲出现肺炎克雷伯菌肝脈肿病例(Moore R，0'aiea D，Geo曲egan T，Mallon PW, Sheehan G. Community-acquired Klebsiella pneumoniae liver abscess :an emerging infection in Ireland and Europe. Infection 2013;41(3) :681-6.);至今，肺 炎克雷伯菌肝脈肿遍及全球。随着科技的发展，超声或CT定位下经皮穿刺引流联合高效广 谱抗生素是治疗肺炎克雷伯菌肝脈肿的有效方式，但肺炎克雷伯菌肝脈肿病死率仍达4-16%(Wang J,Liu Υ,Lee S,Yen Μ,Chen Y,Wang J,Wann S,Lin H.Primary liver abscess due to Klebsiella pneumoniae in Taiwan.Cl in Infect Dis.1998;26:1434-8)。其主要原因为肺炎克雷伯菌肝脈肿不能及时诊断，从而耽误有效治疗。
[0004] 临床上，肺炎克雷伯菌肝脈肿常伴发其他部位的感染，常见的是血流感染、眼炎和 脑膜炎。除了其伴发感染的典型症状外，肺炎克雷伯菌肝脈肿本身的临床表现没有其特征 性，主要表现为发热、寒战和腹痛（Chan K，Yu W，Tsai C，Cheng K，Hou C，Lee M，Tan C.Pyogenic liver abscess caused by Klebsiella pneumoniae: analysis of the clinical characteristics and outcomes of 84patients.Chin Med J(Engl)2007；120: 136-39)。其实验室检查指标的变化(如白细胞计数、中性粒细胞比例和肝功能指标等)也并 非肺炎克雷伯菌肝脈肿所特异化ee S,畑en Y，Tsai H，Wann S，Lin H，Huang C，Liu Y.Predictors of septic metastatic infection and mortality among patients with Klebsiella pneumonialiver abscess.Clin Infect Dis 2008;47:642-50)。因此，临床上 往往容易遗漏肺炎克雷伯菌肝脈肿的相关检查。肺炎克雷伯菌肝脈肿的诊断存在不少的困 难。临床上，肺炎克雷伯菌肝脈肿的诊断金标准是超声或CT引导下经皮肝穿刺抽吸脈液，脈 液中分离培养到肺炎克雷伯菌。但是，脈腔中的细菌往往因为患者前期抗生素的使用W及 大量白细胞的吞隧和裂解，多为死菌，培养阳性率较低。血液中分离培养到肺炎克雷伯菌， 结合肝脏脈腔占位的影像学结果，也能作出肺炎克雷伯菌肝脈肿的推测性诊断，但如果是 早期的肝脈肿，脈腔隐匿，影像学上表现不明显，如不加 W注意，就容易漏诊。加之，血培养 耗时长，从血培养阳性报警，到最后鉴定出菌种，还需要24-48小时，耽误肺炎克雷伯菌肝脈 肿的诊断。
[0005] 本发明目的在于找到致肝脈肿肺炎克雷伯菌的特异性因子，从而通过简单、快速 的PCR方法筛查运些因子在血培养阳性患者血液中的存在情况，如特异性因子PCR结果阳 性，说明该患者血中很可能存在致肝脈肿肺炎克雷伯菌，提示临床医生该患者患肺炎克雷 伯菌肝脈肿概率很高，从而指导临床医生及时开具肺炎克雷伯菌肝脈肿相关的检查，提高 肺炎克雷伯菌肝脈肿的诊断速度，及时治疗，为改善患者预后提供基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC，所述的基 因特异性序列为SEQ ID NO.2所示。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC的 引物：
[000引 asnC_F:ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG
[0009] asnC_R:GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA
[0010] 本发明还有一个目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC或 基于asnC设计的引物在制备致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺 炎克雷伯菌肝脈肿早期诊断试剂盒中的应用。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术措施：
[0012] 致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC，所述的基因特异性序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC的引物，基于asnC序列设计的引物均 为本发明的保护范围，优选的，asnC的引物为：asnC_F: ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG; asnC_ R：GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA 〇
[0014] 致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列asnC或基于asnC设计的引物在制备致肝 脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括WasnC序列为有效标记物在制备致肝脈肿肺 炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，或者W基于asnC序列设计的引物为有效组分在制备致肝 脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，或者序列asnC或基于asnC设计的引物在制备肺炎 克雷伯菌肝脈肿诊断试剂盒中的应用，该试剂盒还可用于肺炎克雷伯菌肝脈肿早期诊断。
[0015] -种致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒，包括：
[0016] sdm_F：TTGAATCTTACCCAGAGGAACTT
[0017] sdm_R：AACAGCACCTTTCACAACGACAT
[0018] asnC_F：ATGCTGGATAAGAAAGATAAGGAG
[0019] asnC_R：GCATACTATTGACCTGCGAAACGAA 〇
[0020] 与现有技术相比，本发明具有W下特点：
[0021 ]目前对致肝脈肿肺炎克雷伯菌分子特征的研究主要局限于筛查普遍报道过的微 生物毒力基因，且特异性不好。本发明通过2株分离自中国大陆的致肝脈肿肺炎克雷伯菌， 对其基因组进行测序，综合了第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，比较 基因组学(Comparative Genomics)及生物信息学(Bioinformatics)方法，并采用科学的统 计学方法，更全面、更系统地寻找分析致肝脈肿肺炎克雷伯菌的特异性基因。
[0022] 目前尚无很好的用于肺炎克雷伯菌肝脈肿诊断的分子标志物，而本发明获得了致 肝脈肿肺炎克雷伯菌Ξ段特异性序列，该序列具有很高的特异性，可W用于肺炎克雷伯菌 肝脈肿的诊断，具有商业化开发价值。
[0023] 申请人从细菌全基因组组学角度出发，从临床分离到致肝脈肿肺炎克雷伯菌和非 肝脈肿患者血液中分离的肺炎克雷伯菌，送全基因组测序，测序结果与网上公布的致肝脈 肿肺炎克雷伯菌和非致肝脈肿肺炎克雷伯菌全基因组比对分析，结果发现几个与致肝脈高 度相关的肺炎克雷伯菌基因，分别为sdm、lak和asnC。申请人进一步用sdm、lak、asnC的特异 性引物分别在临床分离的致肝脈肿和非致肝脈肿肺炎克雷伯菌中做了测试，结果显示:在 致肝脈肿肺炎克雷伯菌中，sdm的阳性率达100 %，lak和