一株水貂肺炎克雷伯氏菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株水貂肺炎克雷伯氏菌，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapeneumoniae)属于肠杆菌科，克雷伯菌属，革兰氏 染色为阴性（G)。兼性厌氧，无鞭毛和芽抱，有明显的芙膜，多数菌株有菌毛。肺炎克雷伯氏 菌有K(芙膜）抗原与0 (菌体）抗原，前者为脂多糖类，后者为多糖类。K抗原可用于菌型的 鉴定。根据芙膜多糖化抗原）分型，可将肺炎克雷伯氏菌分为82个K血清型，其中K1，K2 和K5血清型是与人和动物体的严重感染性疾病密切相关的。该菌于1883年化iediander 从患大叶性肺炎病人的肺组织中首次分离得到，该菌是医院获得性肺炎（HAP)的常见致病 菌，近年来在人类感染中该菌是除大肠杆菌外的医源性感染最重要条件致病菌，该菌可引 起全身多个部位发生感染，但在尿路和呼吸道的发病率最高，当机体的免疫力降低或者由 于长期大量的使用抗生素而导致机体菌群失调时而引起感染，可导致肺炎、脑膜炎、肝脈 月中、眼内炎、泌尿系统发炎、伤口感染和全身败血症等，给临床治疗带来了很大困难，发病率 和死亡率极高。在动物感染中各种家畜、家禽、野生动物及水生动物都可感染，家禽中肉鸡 和蛋鸡都易感染，家畜中猪、牛、羊和懒兔均可感染该病，此外野生及水生动物中的大熊猫、 金丝猴、中华藝等也可感染，其中W小白鼠和15日龄W内小鸡对本菌最易感。近几年来动 物感染克雷伯氏菌病的报道不断增多，该菌可W导致维鸡肝脏坏死，家兔的肺炎、肠炎，大 熊猫的腹泻、肝炎，猪的腹泻W及牛、羊死亡等，并可引起毛皮动物水貂、廳鼠、竹鼠等大量 死亡。由于抗生素类药物的滥用，导致该菌的耐药性不断增强，多重耐药菌株的出现，给临 床治疗带来极大困难。
[0003] 肺炎克雷伯氏菌不仅对畜禽的危害越来越严重，而且引起毛皮动物（狐狸、骆子、 水貂）的发病率也呈上升趋势，导致毛皮动物的肺炎、子宫炎、乳腺炎及其它化脈性炎症。 在国外，1947年Morris在美国首次报道了貂克雷伯氏菌病，W脈肿蜂窝织炎后躯麻搏和 脈毒败血症为特征，在国内，赵纯德等在1987年首次报道了舟山市两个貂场发生肺炎克 雷伯氏菌，W颈部急性脈肿为主要特征，病死率较高。此后国内外陆续出现肺炎克雷伯氏 菌引起毛皮动物发病的报道。国内目前已有学者报道过肺炎克雷伯氏菌在小鼠上的半数 致死量，马磊等从竹鼠中分离的克雷伯氏菌对小白鼠的半数致死量为4. 5XlO^CFU/只；张 诗渝等测定了分离株KPm0912与标准株KP1300的半数致死量，分别为1. 1Xl〇5CFU/mL和 1. 3Xl〇6CFU/mL;钟世励等从毛皮动物分离的肺炎克雷伯氏菌K1对小鼠的半数致死量为 1. 53X108CFU/mL;王剑等从水貂中分离的两株克雷伯氏菌KP-ZC1和KP-ZC2半数致死量分 别为4. 9Xl〇6CFU/mL、3. 1Xl〇6CFU/mL;李富祥等分离的KP14013株对小白鼠半数致死量 为 3Xl〇i'Sc即。
【发明内容】
[0004]本发明从水貂克雷伯氏菌病病料中分离克雷伯氏菌，经划线分离、纯化培养得到 一株毒性优异的克雷伯氏菌；经聚合酶链式反应（PCR)、透射电镜及核酸序列分析等方法 鉴定、证实分离株为肺炎克雷伯氏菌；为下一步深入开展肺炎克雷伯氏菌的相关研究及控 制提供了一定的基础。
[000引技术方案 一株水貂肺炎克雷伯氏菌，命名为WM0K株，保藏号：CGMCCNO. 11222。
[0006] 本发明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株为K2型，革兰氏染色为阴性（G-)，兼性厌 氧，无鞭毛和芽抱，有明显的芙膜，多数菌株有菌毛，呈两端纯圆的杆状。
[0007] 本发明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株，其耐药性情况为： 耐药：氨节西林、氨节青霉素、头抱挫林、头抱他晚、头抱曲松、头抱化朽、安曲南、庆大 霉素、复方新诺明； 中敏：妥布霉素、环丙沙星； 敏感：赃拉西林、头抱替坦、厄他培南、亚胺培南、阿米卡星、左氧氣沙星、巧喃妥英。
[0008] 本发明的水貂肺炎克雷伯氏菌的获取方法： 将病死水貂(死亡前主要表现为精神不振、消瘦呼吸困难等）肝脏内部组织在尿路菌群 显色培养基上于37°C恒溫培养12小时；挑取单个蓝灰色菌落(肺炎克雷伯氏菌在尿路菌群 显色培养基上生长为蓝灰色菌落）将其在膜蛋白腺大豆琼脂培养基上划线分离，进行菌落 的纯化。
[0009] 对纯化好菌落进行PCR扩增，对扩增产物进行序列测定，PCR反应产物测序后的结 果进行Blast,与GenBank中的已发表的水貂肺炎克雷伯氏菌的基因序列相对比，同源性 达到 99%-100〇/〇。
[0010] 本发明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株，对KM小鼠的LDs。为2. 1X10°'5CRJ。毒力 明显强于目前已报道的其它克雷伯氏菌菌株。
[0011] 本发明首次测定了肺炎克雷伯氏菌在水貂上的LDw，本发明的水貂肺炎克雷伯氏 菌WM0K株，对水貂的LDs。为 3. 8X10 °'7CRJ。
[0012] 有益效果 本发明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株毒性很强，可作为后续产品研发时的攻毒用菌 株。
[0013] 保藏信息 保藏时间：2015年8月11日 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 保藏编号：CGMCCNO. 11222 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 分类命名：肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapeneumoniae)。
【附图说明】
[0014] 图1，肺炎克雷伯氏菌PCR扩增产物的电泳图：M水貂肺炎克雷伯氏菌DNA标准 DL2 000:1-6.命名为肺炎克雷伯氏菌WM0K株菌落的PCR产物；7阳性对照购买于美国 标准生物品收藏中屯、的肺炎克雷伯氏菌ATCC700603作为对照）;8.阴性对照购买于美 国标准生物品收藏中屯、的大肠杆菌ATCC25922作为阴性对照）； 图2,电镜下观察到的本发明的肺炎克雷伯氏菌WMOK株的照片。
【具体实施方式】
[0015]下述实施例中，病料来自山东某规模化水貂养殖场，病貂死亡前主要表现为精神 不振、消瘦呼吸困难等。SPF级昆明小鼠购自山东省实验动物中屯、。膜蛋白腺大豆琼脂培