专利名称：一株克雷伯氏菌株及其处理土壤和果蔬表面毒死蜱农药残留的方法
技术领域：
本发明属于环境微生物修复技术领域，具体涉及到克雷伯氏dsp-B菌株及其处理土壤和果蔬表面毒死蜱农药残留的方法。
背景技术：
水果、蔬菜是人们必不可少的生活必需品，农药是果蔬生产过程中防止病虫草害、 保证其质量必不可少的选择。但是，近年来，蔬菜的质量安全问题，特别是蔬果中的残留农药导致的中毒相继进入人们的视野，如福州“毒李子”事件、福建安溪“毒空心菜”事件、海南“毒豇豆”事件、广西“毒白菜”事件。果蔬中的农药残留不仅危害着人的健康，而且严重制约了我国的农产品出口。2005年，中国农产品出口达271. 8亿美元，同比增长17.7%。但与此同时，我国有90%的农业及食品出口企业受国外绿色壁垒措施的影响，每年损失约90 亿美元。因此，寻求高效、安全、经济的农产品农药残留处理已成为科研工作者亟待解决的科研命题。农药残留及其废水的降解主要有微生物降解、化学降解和光降解等方式。微生物能够通过各种生物化学作用将坏境中的有机污染物转化为(X)2和H2O等无毒或毒性较小的物质。与物理、化学降解方式相比，微生物降解具有操作简单、降解彻底、无二次污染等优点。因此利用微生物技术处理农药残留，并对受污染的土壤与水体进行生物修复是一种行之有效的方法。毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高效农药的新型高效、低毒替代品种，作为一种广谱型有机磷酸酯类杀虫剂，被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治。由于其大量频繁使用和它的持久性，在水体、土壤、和植物等环境样品中大量检出毒死蜱残留。毒死蜱属中度毒性杀虫剂，能抑制人体胆碱酯酶活性，蓄积于神经系统后导致恶心、头晕、甚至神志不清，高浓度暴露可造成呼吸麻痹和死亡。因此，寻找一种去除环境中毒死蜱农药残留高效安全的方法成为关注的焦点，而利用毒死蜱高效降解菌剂应用于其污染环境的治理具有重要的现实意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对目前农业生产中农药残留污染的实际问题和需要，提供一种毒死蜱杀虫剂降解菌。本发明的另一目的是提供了使用毒死蜱降解菌制备油包水菌剂的方法，从而通过缓释作用缓慢维持菌种营养物质的供给，大大延长产品的保质期，使用本菌剂产品可以使毒死蜱残留量降低85%左右，且生产成本低廉，使用方便，具有广阔的市场前
旦
ο技术方案
本发明提供一种毒死蜱降解菌，该菌株为革兰氏染色阴性的克雷伯氏菌属 (Klebsiella sp.)，主要生物学特性为G_，兼性厌氧菌，菌体呈球杆状，单个、成对或短链状排列，长0. 8-1. 2 μ m，宽2. 0-2. 4 μ m,不运动，有荚膜，不形成芽孢。在LB培养基培养12h的菌落直径为0. 5mm，呈半球形，半透明，湿润，表面光滑，电镜照片如图1所示；能利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，氨作为氮源；发酵葡萄糖产酸产气；甲基红实验呈阴性；VP反应显阳性；三塘铁琼脂试验不产生硫化氢。该菌株16SrDNA的Genbank登录号为HQ836365。能利用毒死蜱为唯一碳源和能源进行生长，将其彻底矿化为C02和水及简单的无机化合物。 在实验室条件摇瓶试验中，毒死蜱降解率达85%以上。该菌的最适生长pH为7. 0-7. 2，最适生长温度为35°C。该降解菌可以通过发酵工业通用发酵设备进行生产，成本低廉，菌剂直接喷洒使用方便，易于推广大规模应用；
使用上述毒死蜱降解菌生产菌剂产品的工艺流程为斜面种一药瓶种子液一种子罐一发酵罐一菌剂产品；
本发明的详细实施步骤为
(1)挑取毒死蜱残留降解菌Klebsiellasp . dsp_B的单菌落接种于试管斜面；
(2)将毒死蜱残留降解菌dsp-B的斜面种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；
(3)将上述培养好的菌液按15%体积接种量转入种子罐，继续培养至对数生长期；
(4)将达到对数生长期的种子液按15%的接种量接入生产罐中培养；
(5)发酵完成后将细菌培养液制成油包水剂型，并用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型产品；
步骤2中所述LB培养基配方为酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L, pH 7. 0-7. 2 ；
步骤3与4中种子罐和发酵罐的培养基相同，配方为葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L ,K2HPO4 2 g/L, MgSO4*7H20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L，NaCl 1.0 g/L，酵母膏 0.5 g/L，pH :7. 0-7. 2 ；
种子罐和发酵罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0. 8-1. 5，搅拌速度为150-220 转/分钟，培养温度为^_35°C，全程培养时间为48-72小时，结束后菌体40亿个/ml ；
步骤5所研制的油包水剂型中添加的油相为10号白油，乳化剂为spanSO，助溶剂为吐温80。将发酵液制成油包水后可使其中的营养物质悬浮稳定地包裹在降解菌周围，通过缓释提供营养底物保持菌种的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以给降解菌提供适宜的湿润环境，从而大大延长菌剂产品的保质期。使用时直接喷洒到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使营养物的缓慢释放从而维持菌的活性，提高果蔬表面农残的降解率，同时还可防止果蔬失水、褐变等现象的发生。本发明的有益效果为
1本发明提供一种有机磷农药毒死蜱的降解菌，实验室生物降解实验和田间实验结果表明，对毒死蜱的降解率达到85%左右；
2使用该方法生产的毒死蜱降解菌剂具有生产成本低，使用方便，降解效果好的优点， 适合在粮食蔬菜水果生产出口基地和绿色食品生产基地大规模使用。该发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，增加农产品的附加值有着重要的意义。
图1 克雷伯氏菌dsp-Β的电镜照片； 图2 降解菌株dsp-B在土壤不同处理中的毒死蜱降解曲线。
具体实施例方式实施例1
采集成都农泉驿区连续几年施用毒死蜱杀虫剂的桃园田表层土壤。称取采集的农药污染土样5g加到IOOml含100mg/l毒死蜱的灭菌基础盐培养基中，基础盐培养基的配方为 (均为 g/L) NH4NO3 1. 0，MgSO4·7Η20 0. 5，(NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 0. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4 1. 5， PH 7. 0-7. 2，于37°C，180r/min振荡培养7d。用第一次的富集培养液按5%的体积比接入相应的IOOml基础盐培养基中，同时毒死蜱浓度提高至200mg/L，在同样的条件下培养。 7d后取5ml菌液再接入同样培养基中37°C下培养，传代过程中毒死蜱的浓度逐步提高到 1000mg/l，再传代4次，大约7d传代1次。将富集的农药降解菌菌液用无菌水作10倍梯度(10_4、10_5、10_6 )稀释，分别取0.1 ml菌悬液涂布于含有50 mg/L毒死蜱的无机盐固体培养基上，37°C培养；当平板出现菌落时，将单菌落在无机盐农药平板上划线分离、纯化菌株。将生长快、菌落规则、传代稳定的单菌落斜面保存。将初筛得到的5株菌活化，接入 100mg/l毒死蜱基础盐培养基中，37°C，180r/min培养10d，测其降解率。通过复筛，得到降解率最高的菌株B。经16SrDNA序列分析，发现菌株B与Klebsiella 200916的序列相似性为99%，与Klebsiella sp. MS6的序列相似性也为99%，GenBank登录号HQ836365。因此B应归属于克雷伯氏菌属，主要生物学特性为G_，兼性厌氧菌，菌体呈球杆状，单个、成对或短链状排列，长0. 8-1. 2 μ m，宽2. 0-2. 4 μ m,不运动，有荚膜，不形成芽孢。在LB培养基培养12h的菌落直径为0. 5mm，呈半球形，半透明，湿润，表面光滑；能利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，氨作为氮源；发酵葡萄糖产酸产气；甲基红实验呈阴性；VP反应显阳性； 三塘铁琼脂试验不产生硫化氢； 实施例2
取实施例1中革兰氏染色阴性的克雷伯氏菌的斜面接种于IOOmlLB培养基中，LB培养基(g/Ι)配方如下蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7. 0-7. 2，恒温振荡培养至对数期，获得菌液。将上述培养好的菌液按15%体积接种量转入已经121°C高压湿热灭菌并冷却至35°C左右的种子罐，种子罐培养基配方为葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/ L, MgSO4·7Η20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L, NaCl 1. 0 g/L，酵母膏 0.5 g/L, pH 7. 0-7. 2;继续培养至对数生长期，培养过程中无菌空气的通气量为1:1. 5，搅拌速度为 200转/分钟，培养温度为35°C。将达到对数生长期的种子液按15%的接种量接入生产罐培养，发酵罐所用培养基与种子罐相同，接种后的发酵温度控制在^_35°C，无菌空气的通气量为1:0. 8-1. 5，搅拌速度为150-220转/分钟，全程发酵培养时间为48-72小时，发酵结束后菌体数量达到40亿个/ml。发酵完成后按照一定的油水比例在乳化剂的作用下将细菌培养液制成油包水剂型，然后用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型； 应用例1
在实验室摇瓶条件下，应用实施例2中的液体降解菌剂，按5%的接种量接种于50ml毒
死蜱浓度为100mg/l的无机盐培养基中，在35°C，pH=7. 2，180r/min下培养，于培养后的第
3，6，9，12(1取样测其毒死蜱残留浓度。对照为不加降解菌。12(1后毒死蜱的降解率为85. 5%，
而对照的降解率只有5. 2% (见表1)；
表1.克雷伯氏菌在实验室摇瓶条件下对毒死蜱的降解
权利要求
1.一种毒死蜱农药残留降解菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阴性的克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的dsp_B菌株，主要生物学特性为G_，兼性厌氧菌，菌体呈球杆状，单个、成对或短链状排列，长0. 8-1. 2 μ m，宽2. 0-2. 4 μ m,不运动，有荚膜，不形成芽孢；在LB 培养基培养12h的菌落直径为0. 5mm，呈半球形，半透明，湿润，表面光滑；能利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，氨作为氮源；发酵葡萄糖产酸产气；甲基红实验呈阴性；VP反应显阳性；三塘铁琼脂试验不产生硫化氢；该菌株16SrDNA的Genbank登录号为HQ836365。
2.利用权利要求1所述的克雷伯氏降解菌株研制成毒死蜱残留降解菌剂，其特征在于，具体制备工艺如下(1)挑取毒死蜱残留降解菌Klebsiellasp . dsp-B的单菌落接种于试管斜面；(2)将毒死蜱残留降解菌dsp-B的斜面种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；(3)将上述培养好的菌液按10-15%体积接种量转入种子罐，继续培养至对数生长期；种子罐所用的培养基配方为葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/L, MgSO4·7Η20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L，CaCO3 3g/L，NaCl 1.0 g/L，酵母膏 0. 5 g/L，pH :7. 0_7· 2 ；(4)将达到对数生长期的种子液按10-15%的接种量接种入生产罐中培养；生产罐所用的培养基配方与种子罐一样；(5)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1. 5，搅拌速度为 150-220转/分钟，培养温度为^_35°C，全程培养时间为48-72小时，结束后菌体40亿个 /ml ；(6)发酵完成后将细菌培养液制成油包水剂型；油相制备取6份span-80和94份10 号白油混勻高压灭菌备用；水相制备向活化好的细菌发酵液中加入4%的灭菌吐温80并充分溶解；乳化制剂先将油相倾入置立式胶体磨中，在低速搅拌下缓慢加入水相(油相和水相按1 :3的比例充分混合)，然后高速搅拌;3min-5min，快速乳化成油包水状，用塑料包装桶或包装瓶分装成油包水液体剂型。
3.根据权利要求2所述的毒死蜱残留高效降解菌剂的制备方法，其特征在于步骤(6) 所述发酵液制成油包水产品时，需加入一定比例的spanSO作为乳化剂，其HLB值为4. 3， 能使互不相溶的油水两相相互混溶，并形成均勻分散的油包水乳化体系；微生物菌剂施用到环境中以后容易受环境因素影响而丧失活性，这些因素中最重要的是营养元素和水分供给；将发酵液制成油包水后可使其中的营养物质悬浮稳定地包裹在降解菌周围，通过缓释提供营养底物保持菌种的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以给降解菌提供适宜的湿润环境，从而大大延长菌剂产品的保质期；使用时直接喷洒到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使营养物的缓慢释放从而维持菌的活性，提高果蔬表面农残的降解率，同时还可防止果蔬失水、褐变等现象的发生。
4.如权利要求1所述的克雷伯氏菌dsp-B在处理水体、土壤及果蔬表面毒死蜱农药残留上的应用。
全文摘要
本发明提供了一株能降解毒死蜱农药残留的微生物新菌种——克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)dsp-B，Genbank登录号为HQ836365，以及利用该降解菌株研制的毒死蜱农药残留降解菌剂。本发明降解菌剂是利用微生物的技术降解化学农药，属于环境微生物修复技术领域，生产工艺为斜面种→摇瓶种子液→种子罐→发酵罐→产品，其制备工艺简单、生产成本低廉易于大面积推广应用，施用时直接喷洒非常方便，解决了农业生产中农药喷洒该菌剂产品后可快速、高效地降解水体、土壤及果蔬表面的残留毒死蜱含量，从而残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品，有效提高农产品的品质和经济价值。
文档编号A62D101/28GK102517234SQ201110443310
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者唐敦义, 徐恒, 杨新元 申请人:四川大学