一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，具体地，涉及一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一 种生产1，3-丙二醇的方法。
【背景技术】
[0002] 1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂、合成聚酯的单体以及合 成其他化学品的原料，特别是用作合成聚对苯二甲酸丙二酯的单体，其中，聚对苯二甲酸丙 二酯是一种性能优良的聚酯材料，有着广阔的应用前景。目前1，3-丙二醇的生产成本相对 较高，限制了聚对苯二甲酸丙二酯的推广应用，且1，3-丙二醇的工业化生产主要采用化学 合成法。近年来已研发了通过生物法合成1，3-丙二醇的技术，其中，生物法合成1，3-丙二 醇利用甘油等可再生资源，具有绿色环保等优势，为1，3-丙二醇的工业化生产提供了一种 新的选择。
[0003] 美国杜邦公司开发了一种利用大肠杆菌工程菌株以葡萄糖为原料发酵生产 1，3-丙二醇的方法。将来源于酵母的甘油合成途径与来源于克雷伯氏肺炎杆菌的1，3-丙 二醇合成途径转入大肠杆菌，该工程菌株利用葡萄糖为原料，可以直接合成1，3-丙二醇， 并利用生产的1，3-丙二醇合成聚对苯二甲酸丙二酯，该技术获得2003年美国总统绿色化 学奖。
[0004]自然界中很多野生微生物利用甘油为原料可以发酵合成1，3-丙二醇，包括丁酸 梭菌、梓檬酸菌、克雷伯氏肺炎杆菌、克雷伯氏产酸杆菌等。由于克雷伯氏肺炎杆菌生产 1，3-丙二醇具有产物浓度高，生产强度大等优点，是广泛关注的一种1，3-丙二醇生产菌 株。但是克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油发酵合成1，3-丙二醇的过程中，还同时合成琥珀酸、 乳酸、乙酸、2, 3- 丁二醇、乙醇等副产物，影响甘油向1，3-丙二醇的转化率和生产强度，同 时也为1，3-丙二醇的分离提取带来负担。利用现有技术中已有的克雷伯氏肺炎杆菌发酵 合成1，3-丙二醇时，甘油向1，3-丙二醇的转化率一般仅为0. 30-0.42g/g，生产强度一般仅 为1. 0-1. 8gAL ? h)，甘油向1，3-丙二醇的转化率和生产强度都有待提高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种克雷伯氏肺炎杆菌及 其应用和一种生产1，3-丙二醇的方法，采用本发明的克雷伯氏肺炎杆菌发酵合成1，3-丙 二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1，3-丙二醇的转化率和 生产强度。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一株在 发酵合成1，3-丙二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1，3-丙 二醇的转化率和生产强度的克雷伯氏肺炎杆菌，因此，第一方面，本发明提供了一种克雷伯 氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae)，所述克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏号为CCTCC NO :M 2015108。
[0007] 第二方面，本发明提供了上述克雷伯氏肺炎杆菌在生产1，3-丙二醇中的应用。
[0008] 第三方面，本发明提供了一种生产1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：将上述克 雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1，3-丙二醇。
[0009] 利用本发明的保藏号为CCTCC NO :M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为 原料生产1，3-丙二醇时，甘油向1，3-丙二醇的转化率可高达0. 54g/g，生产强度可高达 2. 59gAL ? h)，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1，3-丙二醇的转 化率和生产强度，且能够大大降低分离提取1，3-丙二醇的负担。
[0010] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0011] 生物保藏
[0012] 本发明的克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae)于2015年3月13日被 保藏在中国典型培养物保藏中心（缩写为CCTCC，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大 学，中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072)，保藏编号为CCTCC NO :M 2015108。
【具体实施方式】
[0013] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014] 第一方面，本发明提供了一种克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae)，该克 雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M 2015108。
[0015] 其中，本发明的克雷伯氏肺炎杆菌的分离过程可以包括：采集江苏省张家港市水 稻种植田地表以下20厘米处的土壤样品50-60g，用200-250ml蒸馏水悬浮混勾，将混合样 品自然沉降1-2小时，然后取上清液100_150ml，在4000-6000rpm下离心20-30分钟，倒去 上清液，用5-10ml无菌水重悬沉淀。将沉淀悬液涂布于固体培养基，在30-37°C培养24小 时。
[0016] 对于固体培养基的组成没有特别的限定，可以为本领域常用的各种固体培养基， 优选情况下，以1L固体培养基计，所述固体培养基组成为：甘油40g，K 2HP04 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，柠檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和琼脂粉20g。
[0017] 培养24小时后，挑选20-30个无绒毛、透亮、直径为l-2mm的菌落。挑取各菌落并 分别接入至500ml锥形瓶中进行培养，每个锥形瓶中均装有100-150ml发酵培养基，且均加 有0. 5-lg无菌碳酸钙。培养时，恒温振荡器转速为150-250rpm，温度为30-37°C，发酵培养 12小时后，通过气相色谱仪和液相色谱仪对每个锥形瓶中的发酵液中的产物和副产物进行 分析。
[0018] 其中，以1L发酵培养基计，发酵培养基的组成为：甘油40g，K2HP0 4 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，柠檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和微量元素〇. 3mL，其中，以1L微量元素计，微量元素的组成为：ZnCl2 7. 56g，FeCl3 ? 6H20 15. 65g，MnCl2 ? 4H20 6. 28g，CuC12 ? 2H20 1. 32g，CoC12 ? 6H20 6. 42g，H3B03 0? 48g 和 Na2Mo04 ? 2H20 3. 22g〇
[0019] 其中，气相色谱仪（型号为GC-2014C，购自日本岛津公司），色谱柱采用毛细管 柱AT. SE-54(30mX0. 53mmX1.0ym)，FID检测器，N2载气，柱温为120°C，检测器温度为 250 °C〇
[0020] 液相色谱仪（型号为LC-20A，购自日本岛津公司），色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-Aq(4. 6mmX 150mmX5 y m)，流动相为 0? 005mol/L H2S04,流速为 1.0ml/min，柱温箱为 65°C〇
[0021] 其中，一个锥形瓶中的发酵液的检测结果为：甘油为11. lg/L，l，3-丙二醇为 16. 3g/L，2, 3- 丁二醇为0. 4g/L，乙醇为0. lg/L，乳酸为0. 4g/L，乙酸为0. 5g/L，琥珀酸为 0. lg/L。原料甘油向1，3-丙二醇的转化率为0. 56g/g。甘油向1，3-丙二醇的转化率的计 算公式为：
[0022] 发酵结束时1，3 -丙二醇的最终浓度Q /乃x发酵结束时发酵液的体积U) 发酵过程中消耗的甘油总量(g) °
[0023] 将该菌落提取菌株总DNA，进行16sRNA基因序列分析，其16sRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示，结果表明该菌为克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae)，命名为克雷 伯氏肺炎杆菌HM-B2。将该克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO :M 2015108。
[0024] 第二方面，本发明提供了上述克雷伯氏肺炎杆菌在生产1，3-丙二醇中的应用。
[0025] 第三方面，本发明提供了一种生产1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：将上述克 雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1，3-丙二醇。
[0026] 本发明的生产1