专利名称：一株克雷伯氏菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株克雷伯氏菌及其应用。
背景技术：
抑郁症被喻为“心理疾病中的感冒”，随生活节奏的日益紧张、社会竞争的日益增 强等诸多应激因素的加剧，抑郁症的发病呈逐年上升的趋势。世界卫生组织(WHO)估计目 前全球约有抑郁症患者3. 4亿，抑郁症终生患病率6. 1 % -9. 5%，而更年期人群中抑郁症发 病率可高达29. 2-38. 2%。WHO已将抗抑郁药物列为21世纪最迫切需要研发的药物之一。激素替代疗法(hormone replacement therapy, HRT)已被用于更年期妇女抑郁症 的治疗，并显示积极的作用。但长期使用雌激素带来的副作用(如患子宫内膜癌、乳腺癌和 卵巢癌的机率增加等)使植物雌激素(具有雌激素和抗雌激素双重活性，也称作雌激素受 体部分激动剂)类药物的开发研究引起了国际社会的关注。肠二醇(enterdiol，END)和肠内酯(enterolactone，ENL)(见图1)为国际公 认的活性最强的植物雌激素类成分，因其只存在于哺乳动物体内，故又被称为哺乳动物 木脂素。植物中的多种木脂素类成分均可在人体肠道细菌的作用下被转化成为END， 并进一步转化为ENL，如开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol，SEC0)及其苷 SDG(secoisolariciresinol diglucoside)(见图 1)，均为 END 和 ENL 的重要前体物质。亚麻子(亚麻籽，flaxseed，linseed)为亚麻科植物亚麻(Linum usitatissimum) 的干燥成熟种子。亚麻子含有丰富的油脂(α-linolenic acid含量为57% )，为重要的油 料作物。脱脂后的植物残渣亚麻子粕中SDG(以SDG-3-羟基-3-甲基戊二酸低聚体形式而 存在)含量最高(达 4%)。
发明内容
本发明的目的是提供一株克雷伯氏菌及其应用。本发明提供的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，分离自中国人的人体肠道内容物， 菌株名称为Strain Si，已于2009年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No. 3085。本发明还保护克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085在制备开 环异落叶松树脂酚(SECO))中的应用。本发明还保护一种制备开环异落叶松树脂酚的方法，是通过发酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085，得到开环异落叶松树脂酚。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基 可为在无碳源培养基中加入底物得到的培养基；所述底物为亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦 麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中的至少一种。所述无碳源培养基可为如下培养基pH 7-8 ；每升含有NaCl 2_4g，L_半胱氨酸盐 酸盐 0. 2-0. 4g，硫代硫酸钠 0. 2-0. 4g，NH4Cl 0. 5-1. 5g，KH2PO4 2_3g，K2HP041_2. 5g，其余为
3水。所述无碳源培养基具体可为如下培养基PH7. 5 ；每升含有NaC13g，L-半胱氨酸盐酸盐 0. 3g，硫代硫酸钠 0.3g，NH4Cl lg, KH2PO4 2. 6g，K2HPO4L 85g，其余为水。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基 还可为在庖肉培养基中加入底物得到的培养基；所述底物为亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦 麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中的至少一种。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp. ) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基 中，所述底物的浓度具体可为5-60mg/mL。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085可在有氧条件 下进行。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085也可在缺氧条 件下进行。所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085具体可在氧 分压3. 03975-10. 1325kPa的条件下进行。本发明提供的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085可用于生 产开环异落叶松树脂酚，而现有技术中，并没有任何克雷伯氏菌生产开环异落叶松树脂酚 的报道，本发明为生产开环异落叶松树脂酚提供了一种新途径，并且丰富了克雷伯氏菌的 菌株资源，具有重大意义。
图1为END、ENL、SECO和SDG的化学结构。图2为不同培养时间培养液的HPLC色谱图。图3为不同时间点(l-9d)原代培养液中END峰面积变化曲线。图4为不同时间点(I-Ild)第1代和第49代培养液中END峰面积变化曲线。图5为“Strain-49”的10_5稀释菌液在LB平板上菌落生长情况。图6为从“Strain-49”中挑选得到的32个单菌的脉冲场凝胶电泳图谱；图中共显 示33个泳道，其中第16泳道为分子量标准，其余为分离的32个单菌。通过观察电泳条带 的差异，32个单菌可以归属为9类(I-IX)具有不同基因型的菌种。图7为不同培养时间Strain Sl培养液的HPLC图谱。图8为与Strain Sl相似度较高的肠道菌的系统进化关系树；Klebsiel Ia pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 为对照菌。图9为Strain Sl培养液中SECO含量随时间变化曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。实施例均设三次重复试验，定量结果取平均值。以下实施例中所用的无碳源培养基的配制方法如下磷酸缓冲液(PhosphateBuffered Saline, PBS, PH 7.4)制备方法称取 KH2PO4 5. 2g和K2HPO4 3. 7g溶于200mL蒸馏水中，121 °C高压灭菌15分钟，保存于4°C冰箱。还原剂的配制方法称取L-半胱氨酸盐酸盐30mg和硫代硫酸钠30mg，溶于ImLPBS中，121°C高压灭菌15分钟，保存于4°C冰箱。无碳源培养基的的配制方法称取NaCl 3g、NH4Cl lg、磷酸缓冲液100mL、还原剂 IOmL,混合，水定容至1升；调pH为7. 5。实施例1、克雷伯氏菌(Strain Si)的获得以亚麻子粕为底物，END为目标产物，采用传统的传代培养的方法从人体肠道菌群 中筛选具有生物转化活性的单菌或组合菌。一、传代培养1、传代培养方法(1)增菌配制IOmL庖肉培养基(LB)，加入0. ImL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分钟。 另取冻存的人体肠道菌样本ImL(该样本分离自中国人的人体肠道内容物)，接种于庖肉培 养基中，厌氧条件下37°C增菌24小时。(2)接种配制IOmL无碳源培养基，加入亚麻子粕50mg作为底物，用石蜡油覆盖，121°C高压 灭菌15分钟。接种增菌后的菌液ImL于无碳源培养基中，37°C培养。(3)样本检测每隔24h取200 μ L培养液，加入400 μ L水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10 分钟，取上清液300 μ L于离心管中，氮气吹干，加入200 μ L色谱甲醇，12500rpm/min离心3 分钟，取上清液20 μ L，HPLC检测。检测结果显示培养液在24h即可转化产生END，并且其 含量在9天内基本保持稳定，培养至第6天时培养液中END含量相对较高(图2和图3)。因此，采用每间隔6天进行1次传代的培养方式进行活性菌种筛选，具体方法如 下吸取培养6天的培养液lmL，接种于IOmL含有亚麻子粕(50mg)的无碳源培养基中， 石蜡油封存，37°C培养6天；继续同法传代培养，菌种于-80°C保存，将第一代菌液命名为 “ Strain-I ”，依此类推，分别命名为 “ Strain-2 ”，“ Strain-3 ”.......2、传代培养结果随着传代次数的增加，培养液中产生END的转化时间逐渐延长，同时在培养液中 的END含量也逐渐降低。当传代培养至第49代时，转化产生END的时间已经延迟到第3天， 培养液中END含量最高的时间也延迟到第9天(图4)。由此推断活性菌的范围(数目和种类)在第49代菌液中已经被相对缩小，将其命 名为“Strain-49”。活性菌将从“Strain-49”菌群中筛选。二、活性菌的筛选1、“ Strain-49 ” 划板挑单菌采用划板方法从“Strain-49”中挑选单菌。具体方法如下(1)增菌配制IOmL庖肉培养基，加入0. ImL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分钟。另 取“Strain-49”菌液lmL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌24小时。(2)挑选单克隆菌落以无碳源培养基对增菌后的“Strain-49”菌液进行稀释得10_2_10_5稀释菌液，分 别接种于LB平板，37°C培养24小时。培养结果表明接种10_5稀释菌液的LB平板上菌落生长较好，可分清单个菌落，菌落表面观白色，光滑，圆形，湿润，边缘整齐，明显可见大小菌 落(图5)。从该菌液LB平板上随机挑选32个单菌落，分别接种于IOmL庖肉培养基中，厌 氧条件下37°C增菌24小时，增菌后菌液于-80°C保存。2、脉冲场凝胶电泳分析脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是用稀有位点的限 制性内切酶对细菌的染色体DNA进行酶切，得到较大的片段，然后在交变脉冲电场的作用 下进行电泳分析，可将不同大小DNA片段分开，稳定性好，分辨力高。由于使用细菌的原位 酶切，可反映的是整个细菌的基因情况，而不是个别的小片段，因而可以显示基因组的微小 变化，所以采用PFGE法对从“Strain-49”中分离得到的32个单菌进行分析。(1)菌液培养配制IOmL庖肉培养基32份，分别加入0. ImL还原剂和石蜡油，121 °C高压灭菌15 分钟。另取冻存的32个单菌样本各lmL，分别接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌 24小时。(2)细胞裂解和基因组DNA分离参照文献进行(参照文献方法王月丹.医学免疫学与病原生物学实验教程.北 京大学医学出版社，2008)。(3)酶切与脉冲场电泳参照文献进行(参照文献方法LiuS L，Hessel A, Sanderson K Ε. The XbaI-BlnI-CeuL genomic cleavage map of Salmonella enteritidis shows an inversion relative to Salmonella typhimurium LT2. Mol. Microbiol.,1993,10 (3) 655-664)。采用限制性内切酶SpeI消化所获得的电泳条带的数目和大小比较适中、清晰，容 易辨认，不同类型的菌株间差异显著。通过将基因组被消化后片段的多少、位置与分子量 标准进行比较，可以确定该32个单菌来源于9类(I-IX)细菌。如图6所示。编号为1、2、 4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、21、22、23、29 的共 18 个单菌归为同一类细菌(I 类细 菌)，因为占单菌株总数的9/16，推测该类细菌为活性菌群中的优势菌种，该类细菌的基因 组在SpeI消化下均被分为9个片段；编号为3、20、26、28的共4个单菌归为第II类细菌， 该类细菌的基因组在SpeI消化下均被分为11个片段；其余各类细菌分别包括1-3个单菌， 也根据其基因组被消化片段的不同而得以区分。3、1#活性菌株(Strain Si)的获得以亚麻子粕为底物，对已挑选的32个单菌落的转化活性分别进行了考察，发现 单个菌落的培养液中均未检测到END，但1#菌株(Strain Si)的培养液在第3天时检测到 了 SEC0，且随着培养时间的延长，培养液中SECO含量逐渐增加，培养至9天后含量保持稳定 (图 7)。4、Strain Sl菌的菌种鉴定(1)形态鉴定在37°C、氧分压3. 03975-10. 1325kPa的缺氧条件下，Strain Sl在LB培养基上生 长良好，呈灰白色菌落，镜检为格兰阴性菌，无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，部分菌成双排 列。
(2)生化鉴定Strain Sl可以发酵乳糖和麦芽糖，并产酸产气。(3) rRNA测序分析将Strain Sl进行16S rRNA测序分析，与Strain Sl相似度较高的肠道菌的系 统进化关系树如图8所示。与所测菌株Strain Sl的16S rRNA基因匹配程度最好的两株 菌分另 1J为Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (与 Strain Sl 匹配度 99. 5% )和 Klebsiella pneumoniae 342 (与 Strain Sl 匹配度 99.2%)。因此，StrainSl 被推测为来自克雷伯氏菌属(Klebsiella)的菌株。(4)克雷伯氏菌属已知菌种转化亚麻子粕产生SECO的活性为证明Strain Sl是否为该属的新菌种，比较Strain Sl与克雷伯氏菌属11株已 知菌种(表1)转化亚麻子粕产生SECO的活性。表1. 11株已知克雷伯氏菌属细菌的编号及菌种名称
菌种编号菌种名称PlKlebsiella pneumoniae W70P2Klebsiella pneumoniae ozaenae ATCCl 1296P3Klebsiella pneumoniae ATCC13883P4Klebsiella pneumoniae rhinoscleromatis ATCC13 884P5Klebsiella pneumoniae MGH78578P6Klebsiella oxytoca ATCC13182P7Klebsiella terrigone MZ0201
P8Klebsiella planticola MZ0202P9Klebsiella planticola MZ0203PlOKlebsiella pneumoniae M25PllKlebsiella oxytoca M5al①增菌配制IOmL体系的庖肉培养基12份，分别加入0. ImL还原剂和石蜡油，121°C高压 灭菌15分钟。取Strain Sl和Pl-Pll共12株菌的冻存样本分别接种于庖肉培养基中，厌 氧条件下37°C增菌24小时。②培养配制IOmL无碳源培养基12份，同时加入亚麻子粕50mg作为底物，石蜡油覆盖， 121°C高压灭菌15分钟。分别接种增菌后的菌液各ImL于无碳源培养基中，37°C培养。③检测每隔24h取样一次，采用HPLC法监测培养液中转化产物含量的动态变化。
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④结论经过20天的培养发现，同样的培养条件下，只有Strain Sl的培养液中转化产生 了 SEC0，其余11株已知克雷伯菌属细菌均没有任何转化产物。而与Strain Sl基因匹配度 最好且亲缘关系最近的Klebsiella pneumoniae MGH78578 (P5)，虽然在16S rRNA序列上与 Strain Sl有极大的相似度，但是转化亚麻子粕的活性却不同。Strain Sl与本属其他菌种 相比，应该存在某种(或几种)特定的功能基因的不同，从而具有转化亚麻子粕产生SECO 的能力。通过以上鉴定结果，确认Strain Sl为来自于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的 新菌，将其命名为Strain Si，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏号为 CGMCC No. 3085。实施例2、不同氧气条件Strain Sl对亚麻子粕的转化作用一、实验方法(1)增菌配制500mL体系的庖肉培养基，加入5mL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分 钟。取冻存的Strain Sl样本5mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌36小时。(2)接种共分为有氧培养①和缺氧培养②两组，分别加入含有亚麻子粕(60mg/mL)的无碳 源培养基(2L)中。其中有氧培养组①的培养基不加石蜡油，直接121°C高压灭菌15分钟； 缺氧培养组②的培养基用石蜡油覆盖，121°C高压灭菌15分钟。以体积比1 10分别接种 增菌后的Strain Sl菌液，37°C培养。(3)检测 每隔24h取200 μ L培养液，加入400 μ L水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10 分钟，取上清液300 μ L于离心管中，氮气吹干，加入200 μ L色谱甲醇，12500rpm/min离心3 分钟，取上清液20 μ L，HPLC检测。二、检测结果有氧或缺氧条件下的第Id培养液中均可检测到SECO。第3天SECO的含量达到峰值。实施例3、不同培养基中Strain Sl对亚麻子粕的转化作用一、实验方法(1)增菌配制500mL体系的庖肉培养基，加入5mL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分 钟。取冻存的Strain Sl样本5mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌36小时。(2)接种共分为无碳源培养基①和LB培养基②两组，在培养基(2L)中分别加入亚麻子粕 (40mg/mL)，用石蜡油覆盖，121°C高压灭菌15分钟；以体积比1 10分别接种增菌后的 Strain Sl 菌液，37 °C 培养。(3)检测 每隔24h取200 μ L培养液，加入400 μ L水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10 分钟，取上清液300 μ L于离心管中，氮气吹干，加入200 μ L色谱甲醇，12500rpm/min离心3分钟，取上清液20 μ L，HPLC检测。二、检测结果无碳源培养基和LB培养基的l-7d培养液中均可检测到SEC0。实施例4、Strain Sl对不同底物的转化作用一、实验方法(1)增菌配制500mL体系的庖肉培养基，加入5mL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分 钟。取冻存的Strain Sl样本5mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌36小时。(2)接种在无碳源培养基(2L)中分别加入不同的底物(lOmg/mL)，用石蜡油覆盖，121°C高 压灭菌15分钟；以体积比1 10分别接种增菌后的Strain Sl菌液，37°C培养。(3)检测每隔24h取200 μ L培养液，加入400 μ L水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10 分钟，取上清液300 μ L于离心管中，氮气吹干，加入200 μ L色谱甲醇，12500rpm/min离心3 分钟，取上清液20 μ L，HPLC检测。二、检测结果不同底物的l-7d培养液中均可检测到SECO(见表2)。表2不同时间点不同底物培养液中SECO的HPLC峰面积
底物SECO峰面积 (第3天)SECO峰面积 (第7天)海藻20051975芝麻子粕19931863黑麦鼓18641790油菜籽粕19001832小麦麸16211549大麦麸15791406玉米麸14871308燕麦麸15031421牛蒡子19351829实施例5、Strain Sl培养液中SECO的含量测定一、制作SECO标准曲线 精密称定SECO对照品0. 35lmg，加入2mL容量瓶中，甲醇稀释到刻度，配成 175. 5 μ g/mL对照品母液。将对照品母液逐级稀释1倍，得到浓度为175. 5-2. 74 μ g/mL的 对照品溶液。吸取上述溶液分别进样20 μ L，进行HPLC分析。以SECO峰面积(Y)对SECO 浓度(X，μ g/mL)进行回归计算，得回归方程
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Y= 12. 59X-1. 403 (R2 = 0. 9998)；线性范围为 175. 5-2. 74 μ g/mL ；定量限(S/N = 10)为 1. 37 μ g/mL ；检测限(S/N = 3)为 0. 69 μ g/mL。二、培养条件(1)增菌配制200mL庖肉培养基，加入2mL还原剂和石蜡油，121°C高压灭菌15分钟。另取 冻存Strain Sl样本2mL，接种于庖肉培养基中，厌氧条件下37°C增菌36小时。(2)接种配制无碳源培养基2L，加入60g亚麻子粕作为底物，用石蜡油覆盖，121°C高压灭 菌15分钟。以体积比1 10接种增菌后的Strain Sl菌液200mL于无碳源培养基中，37°C培养。(3)检测每隔24h取200 μ L培养液，加入400 μ L水饱和正丁醇萃取，4800rpm/min离心10 分钟，取上清液300 μ L于离心管中，氮气吹干，加入200 μ L色谱甲醇，12500rpm/min离心3 分钟，取上清液20 μ L，HPLC检测。三、培养结果如图9所示，经过24h的培养，培养液中即转化产生SEC0，随着培养时间的延长， SECO含量逐渐增加，6天后达到较高值(65mg/L)。
权利要求
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Strain S1 CGMCC No.3085。
2.克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)Strain Sl CGMCC No. 3085在制备开环异落叶松树脂 酚中的应用。
3.一种制备开环异落叶松树脂酚的方法，是通过发酵克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085，得到开环异落叶松树脂酚。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基是在无碳源培养基中加入底物得到的；所述底物 为亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中 的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述无碳源培养基为如下培养基pH7-8； 每升含有NaCl 2-4g，L-半胱氨酸盐酸盐0. 2-0. 4g，硫代硫酸钠0. 2-0. 4g, NH4ClO. 5-1. 5g， KH2PO4 2-3g、K2HPO4 l_2.5g，其余为水。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基是在庖肉培养基中加入底物得到的；所述底物为 亚麻子、海藻、芝麻子粕、黑麦麸、油菜籽粕、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子中的 至少一种。
7.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085所用的培养基中，所述底物的浓度为5_60mg/mLo
8.如权利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在有氧条件下进行的。
9.如权利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在缺氧条件下进行的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) Strain Sl CGMCC No. 3085 是在氧分压 3. 03975-10. 1325kPa 的条件下进行的。
全文摘要
本发明公开了一株克雷伯氏菌及其应用。本发明提供的克雷伯氏菌为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Strain S1 CGMCC No.3085。克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Strain S1CGMCC No.3085可应用于制备开环异落叶松树脂酚。现有技术中，并没有任何克雷伯氏菌生产开环异落叶松树脂酚的报道，本发明为生产开环异落叶松树脂酚提供了一种新途径，并且丰富了克雷伯氏菌的菌株资源，具有重大意义。
文档编号C12N1/20GK101955892SQ20091008971
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者刘树林, 库宝善, 杨东辉 申请人:北京大学