专利名称：微小RNA-146a在类风湿关节炎治疗中的用途的制作方法
技术领域：
研究涉及微小RNA-146a (miR-146a)在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达水平、 作用途径，以及对滑膜细胞功能的抑制作用。
背景技术：
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性 自身免疫病。未经正确治疗的RA可迁延不愈，甚至导致关节畸形。目前RA的发病机制并 不明确，限制了治疗手段的发展。
微小RNA (microRNA， miRNA)是近年来发现的一类位于真核生物中的长度约21nt的内 源性非编码小分子单链RNA，通过与耙mRNA的3' UTR结合，参与转录后基因表达的调控。 目前的研究表明，近30n/。的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控，miRNA不仅参与了生物体 的正常发育，在疾病的发生中也起着极为重要的作用。MiRNA的发现，为我们了解疾病的发 生机制提供了新的线索。
MiR-146a参与了免疫细胞的发育和分化，也有证据表明RA患者外周血单个核细胞 (PBMC)和滑膜组织中miR-146a^达异常，但目前尚不清楚miR-146a^达异常的意义。本 研究在观察RA患者PBMCs miR-146a及其靶标mRNA表达情况的基础上，进一步探索了 miR-146a对RA滑膜成纤维细胞功能的影响，旨在寻找miR-146a潜在的治疗价值。
发明内容
本研究首先通过检测RA患者PBMCs中miR-146a的表达水平，了解炎症状态下miR-146a的 改变情况。我们选取了诊断明确的RA患者及正常对照各5例，利用密度梯度离心法提取 PBMCs，实时定量PCR (qRT-PCR)检测了PBMC中miR-146a的表达情况，并且与RA患者的 临床资料进行了相关性分析。结果发现，miR-146a在RA患者PBMCs中显著下调，并且与疾病 活动度指标一血沉(ESR)成负相关。提示miR-146a在RA发病中可能起着负调控的作用。为 了进一步了解miR-146a发挥作用的途径，我们检测了与NF- b通路活化密切相关的两个靶标 mRNA—TRAF6、 IRAKI的表达水平。TRAF6、 IRAKI是活化NF-Kb通路、产生TNF-a等炎 症因子的重要因素，目前已证明是miR-146a的靶标之一。但并不清楚在RA中，miR-146a是否 通过这两个靶标mRNA发挥调节作用。我们的结果显示RA中表达下调的miR-146a与上调的TRAF6、 IRAK1水平成负相关，表明miR-146a至少部分是通过TRAF6、 IRAK1在RA的发病中发挥调控作用的。
为了深入了解miR-146a在RA发病中的负调控作用，我们研究了miR-146a对RA患者FLS增殖及炎性因子分泌的影响。实验分两组进行， 一组为肿瘤坏死因子-a (TNF-a)活化组，一组为无TNF-a活化组，脂质体转染化学合成的miR-146a，以无关序列小RNA为阴性对照。48小时后检测FLS的增殖情况，及细胞上清IL-6及IL-8水平。我们发现TNF-ci活化组FLS增殖及IL-8、 IL-6分泌水平明显增高；而miR-146a对两组FLS的增殖及炎性细胞因子IL-6、 IL-8的分泌均有明显的抑制作用。这表明，TNF-ci在RA患者FLS的活化过程中起着重要作用，而miR-146a对RA患者过度活化的FLS具有抑制作用，并且这种抑制作用不受TNF-a的影响。这对于RA的免疫治疗具有重要意义。
图l.RA患者PBMCs中miR-146a^达水平显著降低，差异具有统计学意义(0.74±0.81，
1.82 ±1.35， pO.Ol)。图2.RA患者PBMCsmiR-146a的表达水平与ESR成负相关(r=-0.449， p<0.05 )图3.RA患者PBMCs IRAKI 、 TRAF6表达水平显著上调。IRAKl在RA和正常对照PBMCs中的
表达量分别为2.62土2.04， 1.28土1.32; TRAF6在RA和正常对照PBMCs中的表达量分别为
3.74±5.48， 1.68±1.32， P值均小于0.05。图4. RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标IRAKl成负相关(r = - 0.486, P < 0.01)。图5. RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标TRAF6成负相关(r = - 0.297， P < 0.05)。图6.3H掺入法检测miR-146a对RA-FLS增殖的影响。转染miR-146a 48小时后，在TNF-a活化
组及无TNF- a组，，FLS cpm值分别为8093.00土2592.98和2015.00土544.75均明显低于阴
性对照小RNA (16692.40 ±976.91， 8798.60±1922.08, P值均小于O.Ol)。图7.miR-146a) tRA-FLSIL-6分泌的影响。在无TNF-a组(A)及TNF-a活化组(B)，转染
miR-146a 48小时后，FLS上清IL-6分别为152.59土49.49 pg/ml和16479.05±3710.37
pg/ml，均明显低于阴性对照小RNA(310.82土 123.36pg/ml和27081.47士3874.37pg/ml， P
值均小于O.Ol)。
图8.miR-146魂RA-FLSIL-8分泌的影响在无TNF-a组(A)及TNF-a活化组(B)，转染miR-146a48小时后，FLS上清IL-8分别为294.65±94.78 pg/ml和6549.80士1128.86pg/ml，均明显低于阴性对照小RNA(459.26土 125.79pg/ml和9064.51 士761.99pg/ml， P值均小于0.01)。
具体实施例方式
实施例l: RA患者PBMCs miR-146逮达情况的检测
本研究纳入符合1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准的RA患者30例，同时选取30例年龄、性别相匹配的正常志愿者，获取知情同意，抽取4ml抗凝血。立即予以密度梯度离心法分离PBMC， Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度仪测A260。 MiR-146a的相对表达水平用ACt和2^a计算，U6snRNA作为内参，检测方法相同。实时定量PCR根据上海吉玛公司提供的miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit进行操作。结果发现RA患者PBMCs中miR-146a表达显著下调，见图l。
实施例2: RA患者PBMCs miR-146逮达情况与临床指标相关性分析
为探讨miR-146a^达水平的临床意义，我们对miR-146a^达量与各项临床指标做了Spearman相关性分析，结果发现miR-146a^达量与ESR成负相关，目前未发现与类风湿因子(RF)、抗CCP抗体等其它的临床指标存在相关性。见图2。实施例3: RA患者PBMCsmiR-146a^达情况与靶标mRNATRAF6、 IRAKI的相关性分析
为了了解miR-146a在RA中发挥作用的途径，我们同时检测了RA患者PBMCs中TRAF6、IRAKI的表达量。TRAF6、 IRAKI是能活化NF-Kb通路，产生TOF-a等致炎因子，已被证明是miR-146a的耙标。但RA中miR-146a是否通过TRAF6、 IRAKI发挥调控作用并不明确。我们用qRT-PCR检测了TRAF6、 IRAKI的表达情况，并且与miR-146a做了Spearmaii相关性分析，发现TRAF6、 IRAK1表达明显上调(图3),并且二者的含量与miR-146a均成负相关(见图4),说明miR-146a至少部分通过抑制TRAF6、 IRAKI的表达发挥在RA中的调控作用。实施例4: miR-146a对RA-FLS增殖能力的影响
留取RA患者膝关节置换术后滑膜组织，分离培养滑膜成纤维细胞，使用3代后的细胞进行试验。分成两组， 一组为TNF-a活化组(10ng/ml)， 一组为无TNF-a活化组，分别同时行Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a (序列为
5' -UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'，根据miRBase release 10.1 ，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/，由上海吉玛公司合成)，对照选用无关序列小RNA。转染时使用96孔板，每孔细胞5X103,设三复孔。48小时后收集细胞，3H掺入法检测滑膜成纤维细胞增殖情况。结果发现TNF-a活化组FLS增殖更为明显，但转染miR-146a后对两组FLS增殖均有显著的抑制作用，见图5。实施例5: miR-146a对RA-FLS分泌炎症因子的影响
使用3代以后的RA患者FLS， 5X10"孔接种 12孔板，Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a及阴性对照后，分成TNF-a诱导(10ng/ml)及无TNF-a组，每组均为复孔，ELISA法检测转染48h后FLS上清IL-6、 IL-8的分泌水平。结果表明，TNF-a活化组FLS分泌IL-6、 IL-8更为明显，但转染miR-146a后对两组FLS炎症因子的分泌均有显著的抑制作用，见图7、图8。
权利要求
1、一种单链非编码小RNA，序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’。
2、 权利要求1中的微小RNA在治疗类风湿关节炎中的应用。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于抑制滑膜细胞功能。
全文摘要
本发明鉴定了一种在RA炎症细胞中低表达的microRNA(miR-146a)，并且证实了miR-146a能够抑制RA滑膜成纤维细胞的功能，具有抑炎作用。
文档编号C12N15/11GK101643730SQ20091008963
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者茹 李, 栗占国, 丽 龙 申请人:北京大学人民医院