专利名称：：用于牛结核病诊断的重组蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组蛋白，特别是涉及一种用于牛结核病诊断的重组蛋白及其应用。
背景技术：
：牛结核病(bovinetuberculosis)主要是由牛分技杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种牛慢性消耗性传染病。该病一年四季均可发生，呈世界流行性，在流行严重的地区，感染率可达60%。世界上包括美国、加拿大、澳大利亚等十多个国家已经实现了无结核牛的报道，但近年来，由于野生动物以及人类结核病的发生与流行，使这些结核病控制良好国家的牛群也处在不断检疫和高度警惕之中。牛结核不仅导致了养牛业自身生产力的下降，更重要的是对人类健康构成了严重的威胁。人对牛结核比较敏感，很多病例与感染动物有接触史。由于牛和人类的关系(牛奶、牛肉及制品等)较其他动物更为密切，因此约10%左右的人结核病是由牛分枝杆菌引起；有研究表明，在有结核病奶牛的地区，人的结核感染率可以高达750/。。要从根本上控制牛结核病的发生与流行，首先必须加强对本病的诊断学的研究，事实上，国内外学者也从未间断过对牛结核病诊断方法的不断改进。目前普遍采用结核菌素纯蛋白衍生物(proteinpurifiedderivative,PPD)为抗原进行变态反应(皮内试验，TST试验)进行牛结核病的诊断。PPD试验存在主观性强、耗时耗力、短时间内不能进行重复检测以及对免疫妥协患牛、近期受感染的个体敏感性很低等缺点。90年代后期囯外发展起来的以PPD为抗原的干扰素(IFN)-Y释放试验明显提高了牛结核分枝杆菌诊断的灵敏性，该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和解释上的主观性，试验中没有抗原的渗入以及耗时缩短，目前国外已有商品化的诊断试剂盒生产。但是由于PPD包含的抗原成分复杂，这些抗原在环境分技杆菌、结核分枝杆菌、牛分技杆菌中广泛存在，致使其特异性很差；同时有研究表明，PPD并不能安全区分BCG接种的个体和被环境分枝杆菌感染的个体，其特异性差等问题仍然存在。为了提高牛结核分技杆菌检测的特异性，国内外学者做了大量研究以改进该检测方法，他们利用基因重组和表达技术将牛结核分技杆菌ESAT6、MPB64、MPB70、MPB63、hsp65、Ag85B、CFP10等多种蛋白成份进行了重组表达，并以这些重组蛋白进行了牛结核病的诊断研究，虽然重组表达的单个抗原的特异性有所提高，但敏感性还不够理想。本研究对以上各种蛋白进行了配伍，并用不同分枝杆菌感染的豚鼠进行动物模型试验，结果发现，ESAT6和CFP10二者混合后不仅对牛结核的诊断具有良好的特异性，而且具有令人满意的敏感性。以上研究结果在后来800头牛的临床试验中得到了证实。虽然已有体外表达CFP10和ESAT6的研究报道，但目前尚未有人将2者的表达产物或共表达产物用作致敏原对牛进行皮试试验(TST)，用以检测牛结核感染。
发明内容本发明的目的是针对牛PPD存在的非特异性，及PPD制备繁瑣的不足，提供一种高特异性和高敏感性的PPD替代的重组蛋白，用于牛结核病的诊断。为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于牛结核病诊断的重组蛋白，釆用如下方法得到提取牛结核分支杆菌基因组DNA作为PCR反应的模板扩增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技术扩增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，将其经克隆、转化后获得的重组菌按常规方法诱导表达，表达产物纯化后即得。本发明的重组蛋白，其中所述用基因拼接技术扩增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，可以釆用重叠PCR的方法通过两次PCR实现目的基因的拼接。其具体操作可以为(1)设计4条引物Pl为CFP10上游引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位为连接序列Linker,后面为ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.2所示；P3第1-45位为与引物P2连接序列互补的碱基序列，后面为ESAT6基因上游引物，如SEQIDNo.3所示；P4为ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR扩增首先以P1、P2和P3、P4分别为引物，以牛结核分枝杆菌基因组DNA为模板，扩增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR产物，再以等量的两回收产物为模板，以Pl、P4为引物，扩增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。本发明的重组蛋白，上述方法扩增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示，其中第301-345位为重叠序列。本发明的重组蛋白，在得到目的基因CFP10-ESAT6融合基因后，后续的克隆和转化可釆用常规方法，将目的基因表达。其中一种可选的方法是将目的基因CFP10-ESAT6融合基因片段连接入表达载体pET-32a并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，提取质粒，经双酶切初步筛选阳性克隆，并经序列测定验证克隆。得到的含阳性质粒的重组菌-大肠埃希氏菌诱导表达后的菌体4°C、5000-12000r/min离心10-20min，将沉淀以8-12倍浓缩比例重悬于PBS中，超声波裂解菌体，取上清，过NI-NTA柱，通过咪唑浓度梯度洗脱法纯化重组蛋白。其中超声波功率优选200W,工作10s，间歇10s。上述得到的重组蛋白用作致敏原对牛进行皮试试验(TST),用以检测牛结核感染。一种重组蛋白皮试试验的方法及结果判定可以如下述所示试验方法将重组蛋白用生理盐水稀释成10-20pig/mL,不论牛只大小，一律于颈中部上l/3处剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影响结果判定)，注射重组蛋白前先用卡尺测量拟注射部位的皮皱褶厚度(即双层皮厚)，作好记录。用酒精消毒注射部位后，皮内注射0.1亳升。(小于三月龄牛也可在肩胛部进行试验。)注射后48小时，观察注射部位有无炎性反应，并用卡尺测量皮皱褶厚度。结果判定将注射后48小时所测得的皮皱褶厚度减去注射前所测得的皮皱褶厚度后，再依据以下标准作结果判定。阳性反应试验局部有明显的炎症反应，皮厚差大于或等于3.0mm。疑似反应试验局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm，小于3.0mm。阴性反应试验局部无炎性反应，皮厚差小于2.0mm。凡是判定为疑似反应的牛只，应于第一次试验的60天后进行第二次试验，如结果仍为疑似反应，则经过60天后再试验，还为疑似反应，应判定为阳性反应。对于阴性和疑似反应的牛，应于注射后的72小时和96小时再分别观察一次结果，以防个别牛出现较迟的变态反应。据此，本发明还提供一种牛结核病诊断试剂，其包含有10-20吗/mL的上述所述的重组蛋白。本发明试剂产品分液体制品和冻干制品，均在2-8'C保存，冻干制品的有效期为IO年，液体制品的有效期为2年。本发明还提供一种牛结核病诊断试剂盒，其包含上述的诊断试剂。上述技术方案具有如下优点1、本发明中所用的诊断抗原为牛结核感染早期介导细胞免疫的主要优势抗原，结核感染后该抗原在体内能持续存在，但禽结核、副结核、及卡介苗等极易干扰牛结核诊断的细菌不表达该蛋白质。因此，该试剂不仅能及时诊断出牛结核的感染，在鉴别诊断上也有较大的意义。2、应用基因拼接(Genesplicingbyoverlapextension)的方法进行两基因的连接，并且在两基因的中间引入一段疏水氨基酸linker,能够在连接的同时最大可能的保证两抗原间的空间结构，以保持蛋白的天然活性，避免了分别表达2个蛋白，进行2种蛋白纯化的工作，节省了生产成本。3、经典的TST试验中需要使用PPD,而使用PPD时需要动用牛结核强毒株，增加了生物安全控制成本。本发明只需要用无致病性的大肠杆菌发酵即可获得大量的靶蛋白。4、使用本发明提供的重组蛋白及诊断试剂诊断牛结核病成本低、速度快、高敏感性和特异性。图la是本发明实施例l的基因PCR产物的电泳结果，其中l、2:ESAT6PCR条带，大小为288bp;3、4:CFP10PCR条带，大小为300bp;5:DL2000Marker。图lb是本发明实施例1的基因PCR产物的电泳结果，其中1、2:为CFP10-ESAT6PCR产物；3:DL2000Marker。图2是重组菌的诱导表达产物及纯化产物的SDS-PAGE结果，其中1:中等蛋白分子Marker;2:含pET-32a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解物上清，未经IPTG诱导；3:含pET-32a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解物上清，经IPTG诱导；4:含pCFP10-ESAT6重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解物上清，未经IPTG诱导；5:含pET-CFP10-ESAT6重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解物上清，经IPTG诱导；6:经M-NTA柱纯化后的重组表达产物。具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l:1、目的基因的扩增本发明釆用基因拼接技术(Genesplicingbyoverlapextension)，即重叠PCR的方法通过两次PCR实现目的基因的拼接。共设计4条引物，PI为CFP10上游引物；P2前半段(划线部分)为连接序列(Linker,编码15个疏水氨基酸)，后半段为ESAT6基因下游引物；P3前半段(划线部分)是与引物P2划线部分互补的碱基序列(Linker)，后半段为ESAT6基因上游引物；P4为ESAT6基因下游引物。首先用引物P1、P2扩增出CFP10基因，用引物P3、P4扩增出ESAT6基因，然后取2种基因产物等体积混合后作为模板，用引物PI和P4扩增出CFP10-ESAT6基因。具体操作方法如下1.1引物设计根据GenBank中的鄉co^c&n'wm6ov&AF2122/97(登陆号NC002945)设计引物Pl:5，-GCGAATTCATGGCAGAGATGAAG-3，，如SEQIDNo.l所示；P2:5,-GCTTCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCG-3，，如SEQIDNo.2所示；P3:5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAGGAGGTGGAAGCATGACAGAGCAGCAG-3，,如SEQIDNo.3所示；P4:5'-CCCTCGAGTTACTATGCGAACATCCCAGTG-3，，如SEQIDNo.4所示；Pl、P4划线部分分别为、7//w/m酶切位点，P2、P3划线部分为互补的45个碱基的linker。1.2目的片段的扩增PCR扩增条件为:94。C/10min，94。C/30s、55°C/30s、72°C/2min(30个循环)，72°C/10min。首先以P1、P2和P3、P4分别为引物，以牛结核分枝杆菌基因组DNA为模板，扩增出CFP10和ESAT6基因片段(见图la)，回收PCR产物，再以等量的两回收产物为模板，以Pl、P4为引物，扩增出CFP10-ESAT6融合基因(见图lb)。PCR产物纯化试剂盒回收目的片段。2、重组表达质粒pCFP10-ESAT6的构建用I、///>^///分别双酶切回收的CFP10-ESAT6PCR产物及pET-32a，将两酶切产物回收后按100:l(摩尔比)连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，提取质粒，经双酶切初步筛选阳性克隆，并经序列测定验证克隆。3、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析将含阳性质粒的重组菌一一大肠埃希氏菌pCFP10-ESAT6株菌(2009年7月6日本菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.3168)在LB液体培养基中37。C振荡培养过夜，按1:100接种LB培养基，37。C振荡培养3h，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，30。C继续培养6h。收集未诱导及6h诱导的菌液lmL,离心取沉淀，用200pL的pH7.4的PBS重悬，加入50|iL的5xloadingBuffer，混匀后煮沸5min，各取lO(iL上清液与标准分子量蛋白Maker进行SDS-PAGE电泳(见图2),后用考马斯亮蓝染色。4、重组蛋白的纯化将表达后菌体4°C5000r/min离心15min或12000r/min离心10min，弃上清，将沉淀以10倍浓缩比例重悬于pH7.4PBS中，超声波(功率200W，工作10s，间歇lOs)裂解菌体20min,再次4°C5000r/min离心20min,收集上清，经0.45pm滤膜过滤后，过NI-NTA柱，通过咪唑浓度梯度洗脱法纯化重组蛋白，并根据Bradford法确定重组蛋白浓度。5、重组蛋白皮试试验方法将重组蛋白用生理盐水稀释成10-20昭/mL,不论牛只大小，一律于颈中部上l/3处剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影响结果判定)，注射重组蛋白前先用卡尺测量拟注射部位的皮皱褶厚度(即双层皮厚)，作好记录。用酒精消毒注射部位后，皮内注射O.l亳升。(小于三月龄牛也可在肩胛部进行试验。)注射后48小时，观察注射部位有无炎性反应，并用卡尺测量皮皱褶厚度。6、结果判定标准将注射后48小时所测得的皮铍褶厚度减去注射前所测得的皮鮍褶厚度后，再依据以下标准作结果判定。阳性反应试验局部有明显的炎症反应，皮厚差大于或等于2,5mm。疑似反应试验局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于1.5mm，小于2.5mm。阴性反应试验局部无炎性反应，皮厚差小于1.5mm。凡是判定为疑似反应的牛只，应于第一次试验的60天后进行第二次试验，如结果仍为疑似反应，则经过60天后再试验，还为疑似反应，应判定为阳性反应。对于阴性和疑似反应的牛，应于注射后的72小时和96小时再分别观察一次结果，以防个别牛出现较迟的变态反应。试验例地点山东某奶牛场。时间2007.4试验头数28头检验方法将实施例l提供的重组蛋白用生理盐水稀释成20pg/mL，不论牛只大小，一律于颈中部上l/3处剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎症而影响结果判定)，注射重组蛋白前先用卡尺测量拟注射部位的皮皱褶厚度(即双层皮厚)，作好记录。用酒精消毒注射部位后，皮内注射0.1毫升。(小于三月龄牛也可在肩胛部进行试验。)注射后48小时，观察注射部位有无炎性反应，并用卡尺测量皮皱褶厚度。试验同时在牛颈中部上同一侧进行常规PPD对照。试验结果见表l表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根据本专利中确定的阴、阳性判断标准，4#、5#、10#、11#、13#判为阳性，1#、8#、18#、19#、24#判为可疑。根据PPD的判断标准，5#、10#、13#、19#、24#判为可疑。用进口试剂盒检测，结果4#、5#、10#、11#、13#、19#为阳性，与本专利中申报的重组蛋白检验结果吻合性最好，阳性样品100%吻合，只有第19#样品用重组蛋白检验判为可疑，而试剂盒检测为阳性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>广东大华农动物保健品有限公司<120>用于牛结核病诊断的重组蛋白及其应用<130>KHP09112896.6<160>5〈170>Patentlnversion3.5<210>1〈211>23<212>画<213>人工序列<400>1gcgaattcatggcsgagstgaag23〈210>2<211>59<212>画〈213>人工序列<400>2gcttccacctcctccgcttccaccacctccgcttccaccgccaccgaagcccatttgcg59<210>3<211>60〈212>DNA<213>人工序列<400>3ggtggcggtggaagcggaggtggtggaagcgg鄉aggtggaagcatgacagagcagcag60<210>4〈211>30〈212>DNA<213>人工序列〈400〉4ccctcgagttactatgcgaacatcccagtg〈210>5〈211>633〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccggcagccaataagcatgaagcaggaactcgatcgagatctcgagtcc犯tactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgcggtggcggtgg犯tcggaggtggtgg卿cgg鄉aggtgtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatcccattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagcagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagc肌aaatgggaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagggaagaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag3ggC3ggt犯cgacggcaggcggtggtgcgcgaatattcgtgtcctcgcag犯gcatgax;鄉g3组gttcgcagcggcacgccacggcccggtcaggctttcg3gcggttcgttgcagcttcca3g犯tcaggccggcaatgggcttccacgtccattctggggcggttaccgagctg犯tggcttcg306012018024030036042048054060063权利要求1、一种用于牛结核病诊断的重组蛋白，其特征在于，是采用如下方法得到的提取牛结核分支杆菌基因组DNA作为PCR反应的模板扩增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技术扩增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，将其经克隆、转化后获得的重组菌按常规方法诱导表达，表达产物纯化后即得。2、如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述用基因拼接技术扩增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，是釆用重叠PCR的方法通过两次PCR实现目的基因的拼接。3、如权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述两次PCR包括以下操作(1)设计4条引物Pl为CFP10上游引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位为连接序列Linker,后面为ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo,2所示；P3第1-45位为与引物P2连接序列互补的碱基序列，后面为ESAT6基因上游引物，如SEQIDNo.3所示；P4为ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR扩增首先以P1、P2和P3、P4分别为引物，以牛结核分枝杆菌基因组DNA为模板，扩增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR产物，再以等量的两回收产物为模板，以Pl、P4为引物，扩增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。4、如权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，所述扩增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示。5、如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白，其特征在于，将得到的目的基因CFP10-ESAT6融合基因的片段连接入表达载体pET-32a并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，提取质粒，经双酶切初步筛选阳性克隆，并经序列测定验证克隆。6、如权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于，将得到的含阳性质粒的重组菌-大肠埃希氏菌诱导表达后的菌体4'C、5000-12000r/min离心10-20min,将沉淀以8-12倍浓缩比例重悬于PBS中，超声波裂解菌体，取上清，过NI-NTA柱，通过咪唑浓度梯度洗脱法纯化重组蛋白。7、如权利要求6所述的重组蛋白，其特征在于，所述超声波功率200W，工作10s,间歇10s。8、权利要求1-7任一项所述的重组蛋白在制备检测牛结核感染的致敏原中的应用。9、一种牛结核病诊断试剂，其特征在于，包含10-20pg/mL的权利要求l-7任一项所述的重组蛋白。10、一种牛结核病诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求9所述的诊断试剂。全文摘要本发明公开了一种用于牛结核病诊断的重组蛋白，采用如下方法得到提取牛结核分支杆菌基因组DNA作为PCR反应的模板扩增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技术扩增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，将其经克隆、转化后获得的重组菌按常规方法诱导表达，表达产物纯化后即得。使用本发明所提供的重组蛋白及诊断试剂诊断牛结核病成本低、速度快、高敏感性和特异性。文档编号C12P19/00GK101684160SQ200910089180公开日2010年3月31日申请日期2009年8月3日优先权日2009年8月3日发明者徐家华,陈瑞爱申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司