专利名称：：狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统，其包括编码LEP全长基因组cDNA的重组载体，及其辅助质粒系统，其中所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。本发明还涉及由该反向遗传操作系统构建的LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体。更具体地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统是pCI-LEP及其辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，所述LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP。本发明还涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体二者分别拯救的重组病毒，以及它们的应用。
背景技术：
：狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒RV引起的、侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患性传染病。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感。犬类动物在传播人狂犬病过程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，猫、浣熊、狐狸和蝙蝠等也会患病并传播病毒。狂犬病传播途径主要是通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤侵入机体。此外，还可通过消化道、呼吸道以及动物密切接触等途径传播。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率可高达100%。据世界卫生组织报道，在世界范围内每年约有60,000余人死于狂犬病，引起严重的公共健康问题，主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。中国也是受狂犬病危害最为严重的国家之一。狂犬病病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，为不分节段单股负链RNA病毒，其基因组长约12kb，共编码5个结构蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。自从1940年，Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病病毒Flury株，经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传代后，再经鸡胚传代178代以上，无论神经内、外接种都对动物丧失致病力，但对于新生乳鼠和猴，在脑内接种时仍具有残留毒力[1]。在鸡胚传代68代以前的称为"LEP"(鸡胚低代株)，高于136代的称为"HEP"(鸡胚高代株)。Flmy-LEP株具有优良的免疫原性，被广泛用作人或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株，还被包括中国在内的许多国家用作预防犬狂犬病的弱毒疫苗。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新，取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足。我国目前生产ERA株和Flmy株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。因此，存在获得更加安全的减毒活病毒疫苗株的需要。反向遗传学(ReverseGenetics)是相对于经典遗传学而言的，经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的(由表及里)，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象(由里及表)，故与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术。反向遗传学通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型、性状的直接影响。RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术，该技术通过人为加入DNA基因片段，实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作，为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来，RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展，这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。正链RNA病毒全长基因组RNA转染进入真核细胞，可以导致病毒蛋白表达和病毒复制。相比之下，负链RNA病毒基因组RNA的存在并无感染性。启动病毒的转录和复制，除病毒基因组外，同时需要病毒聚合酶复合体的共表达；此外，还要求病毒基因组与核衣壳蛋白结合形成复合体。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reversegeneticsystem,RGS)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。目前，反向遗传操作技术广泛用于研究病毒的生命周期，病毒装配，病毒蛋白在其致病性中的作用以及病毒蛋白与宿主细胞的相互关系，同时也为我们开发弱毒活疫苗和病毒载体开辟了新的捷径[2]。目前，在国内外尚未有Flmy-LEP株反向遗传操作系统的报道。
发明内容本发明涉及狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遗传操作系统以及由该反向遗传操作系统构建的LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体。更具体地，所述狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遗传操作系统包括pCI-LEP及其辅助质粒系统，其中所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L，并且优选地，所述LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP，所述辅助质粒系统包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。本发明还涉及由所述狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体二者分别拯救的重组病毒，以及它们的应用。在第一方面中，本发明通过将LEP全长基因组cDNA(SEQIDNO:1)克隆至携带CMV启动子的质粒中，并且构建LEP的辅助质粒系统，从而构建了狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统，并在此基础上成功构建了表达绿色荧光蛋白重组病毒载体。所述LEP的辅助质粒系统包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，其分别编码LEP的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)。具体而言，所述携带CMV启动子的质粒包括，但不限于，pCI和pCAGG等。利用携带CMV启动子的质粒的优点在于，携带CMV启动子的质粒利用细胞内的RNA聚合酶II进行转录，而无需传统的T7聚合酶系统，因此理论上可以在任何真核细胞系中拯救病毒。5在一个优选实施方案中，所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统是pCI-LEP及其辅助质粒系统，其中pCI-LEP通过将LEP全长基因组cDNA克隆至pCI质粒中而构建，并且所述辅助质粒系统是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体是pCI-LEP-EGFP，其通过将编码绿色荧光蛋白EGFP的核苷酸克隆至上述pCI-LEP中而构建。在第二方面中，利用本发明第一方面的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统，从Flmy-LEP疫苗株基因组cDNA克隆成功获得拯救病毒株rLEP，并且利用上述表达绿色荧光蛋白的LEP重组病毒载体和辅助质粒系统，成功拯救了表达外源绿色荧光蛋白EGFP的感染性重组病毒株rLEP-EGFP。在第三方面中，本发明鉴定了拯救的Fhiry-LEP(rLEP)的生物学特性。本发明人检测了野生型LEP(wtLEP)和在第二方面中拯救的重组LEP(rLEP)在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动力学曲线，如图5所示，rLEP在两种细胞上的的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明从LEP基因组全长cDNA拯救的rLEP的生长特性与wtLEP是一致的。此外，本发明人还检测了wtLEP和rLEP的嗜神经指数，结果显示在表4中，wtLEP和rLEP的嗜神经指数均为0.8，没有差异。最后，本发明人还检测了wtLEP和rLEP对小鼠的致病性，测定了wtLEP和rLEP的LD5Q，分别为8.8个FFU和2个FFU。结果表明，rLEP与wtLEP对小鼠的致病性没有显著差异。通过以上几项关于rLEP和wtLEP的生物学特性的测定，可见以LEP基因组全长cDNA克隆获救的rLEP与野生毒株wtLEP在生物学特性上并无显著差异。这表明，重组狂犬病病毒株rLEP具有作为预防狂犬病的活载体疫苗应用的潜力。因此，本发明第一方面构建的狂犬病病毒Flmy-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体可以作为在分子水平研究、构建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平台。在第四方面中，本发明提供第一方面所述的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体的应用。利用本发明的反向遗传操作系统，可对Flmy-LEP株基因组毒力相关位点进行定点突变修饰，获得更加安全的减毒活毒疫苗株，研究不同毒力毒株的分子致病机理。另外，表达EGFP的重组Flury-LEP的成功构建还表明所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统还是一个很好的表达外源蛋白的载体，既可在病毒基因组插入导致病毒减毒和增强免疫反应的外源基因，也可插入额外的G基因以增强免疫原性，或者是从基因组中删除某个完整的病毒基因，使病毒无法繁殖而失去毒力。因此，狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统还可以用于构建表达犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其它疫病的重组二联活载体疫苗。所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体也是构建表达其它外源蛋白的重组病毒载体的基础，由其拯救的表达EGFP的LEP重组病毒rLEP-EGFP可以用于直接观察病毒的增殖状态，分析LEP病毒的扩散和致病性，等等。从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中-图1显示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全长基因组cDNA的重组载体pCI-LEP的构建示意图2显示从亚基因组cDNA片段构建rLEP-EGFPcDNA的策略。(a).通过PCR在LEP基因组4卯6位后定点突变，引入PmeI位点，(b).经PCR在EGFP基因5'端引入Pmel位点、GE、GS，在3'端引入Pmel位点，EGFP基因经Pmel位点插入pCI-LEP的G和L之间的基因间隔区；图3是感染拯救病毒rLEP的NA细胞的间接免疫荧光照片。(a)感染拯救病毒rLEP的NA细胞的间接免疫荧光分析照片；(b)以阴性血清为一抗观察IFA结果；图4显示rLEP-EGFP感染BHK-21细胞48小时后荧光显微镜观察显示出自发荧光。(a)rLEP-EGFP感染BHK-21细胞48小时后荧光显微镜观察的自发荧光，(b)空白BHK-21细胞荧光显微镜下观察结果；图5显示野生型LEP(wtLEP)和拯救的rLEP病毒在NA细胞(a)和BHK-21细胞(b)上的生长动力学曲线；图6显示质粒pCAGG(a)和pCI系列载体(b)的图谱。具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。实施例1狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统及其表达绿色荧光蛋白的重组病毒载体的构建和生物学活性1材料1.1质粒、细胞株和病毒质粒pCAGG、pCI-RBz购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，pBluescriptllSK(+)购自clonetech。BHK-21细胞(ATCCCC1-10)和293T细胞(CRL—11268)购自ATCC，培养基均为含10%胎牛血清的DMEM，小鼠脑神经瘤细胞NA细胞购自军事医学科学院军事兽医研究所，培养基为含10%胎牛血清的MEM，狂犬病病毒Flury-LEP购自中国兽医药品监察所，在BHK-21细胞上扩增，-70匸冻存备用。1.2主要试剂和仪器T4DNA连接酶，限制性内切酶MzeI，5^1，M"，五coiI，I等均购自大连TaKaRa公司。PhusionTM超保真DNA聚合酶，限制性内切酶化rII购自NEB公司。RNA提取试剂Trizol，SuperScript"^m反转录试剂盒，无血清培养基Opti-MEM，转染试剂LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司。犊牛血清购自Gibco公司。LB培养基成分均购自OXOID公司。胶回收试剂盒(GelExtractionMiniKit)及质粒小量提取试剂盒(PlasmidMiniKit)均购自OMEGA公司。质粒中量提取试剂盒QIAfilterPlasmidMidiKit购自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室按本领域常规方法制备。FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司。普通显微镜，购自OLYMPUS公司；荧光显微镜，购自ZEISS公司。PCR仪购自AppliedBiosystem公司。核酸测序采用BECKMANCEQ8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购LABCONCO自公司。二氧化碳培养箱购自ThermoElectron公司。不同型号离心机均购自BECKMAN8公司。-70^超低温冰箱购自仰8公司。普通冰箱冰柜购自海尔公司。全自动净水机MILI-Q购自BIOCEL公司。各种规格细胞培养瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。1.3引物参照GeneBank中所提供的Flury-HEP株基因组序列(GeneBank序列号AB085828)禾口Flury-LEP序列(GeneBank序列号DQ099524)，将Flury-LEP全长基因组cDNA序列(SEQIDNO:1)分为3段，艮P，Fl，F2禾口F3，分别设计PCR弓1物。其中，片段F1为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的1-4063核苷酸序列(SEQIDNO:2)，片段F2为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的4013-8254核苷酸序列(SEQIDNO:3)，片段F3为Flury-LEP全长基因组cDNA序列的8187-11925核苷酸序列(SEQIDNO:4)。构建上述全长基因组cDNA所用引物(表l)和构建辅助质粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技术有限公司合成。_表lRT-PCR和全长基因组cDNA构建所用的引物引物名称引物序列F1-PF」G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'F卜PR5'-GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC-3'F2-PF5'-AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA-3'F2-PR5'-ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC-3'F3-PF5'-TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC-3'_AQ-3'_注cDNA片断与图l相一致。下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜体表示。_表2辅助质粒构建所用的引物_引物名称引物序列_^_L-N-PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGGATGCCGACAAGATTGT-3'L-NPR5'-CCGGGTACCTC,TATGAGTCACTCGAATACG-3,L-P-PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA-3'L-P-PR5'-CCGGGTACqXg^fTTAGCATGATGTGTAGCGATCC-3'L-L—PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA-3'L-L-PR5'-CCGGGTACCITTAITTACAAACAACTGTAGTCTA-3'注下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，突变碱基用字符边框表示，Kozak序列用斜体表示。1.4病毒基因组的提取、反转录和PCR取Flury-LEP病毒液250pL，加入750pLTrizol，经常规方法提取基因组RNA。提取的RNA用SuperScript，III反转录试剂盒进行反转录反应(反转录引物见表l)，按该试剂盒说明书方法进行，获得末端部分重叠的3个病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1.5RT-PCR产物的克隆以1.4中获得的末端部分重叠的3个病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段为模板，将整个基因组分为末端部分重叠的3个片断进行RT-PCR扩增，PCR产物经lQ/^琼脂糖凝胶电泳，以胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收Fl、F2和F3片段，分别克隆至pBluscriptIIKS(+/-)(Clontech)多克隆位点，转化感受态细胞DH5(x，提取阳性质粒，测序确保克隆的基因组片段与病毒基因组RNA序列完全一致。1.6Fhiry-LEP基因组全长cDNA克隆的构建利用基因组cDNA片段Fl、F2和F3相邻重叠部分存在的限制酶切位点进行连接组装(示意图见图l)。具体地，参见图l，首先将F3段cDNA经A^eI和及wII位点克隆进pCI-RBz(pCI质粒图谱见图6b)，所得质粒命名为pCI-F3，再将Fl段经iWzeI和MwI插入至UpCI-F3，所得质粒命名为pCI-F31，最后将F2段经5^/2I和MwI克隆进pCI-F31，至此Flury-LEP全基因组cDNA组装完成，构建成的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP。该克隆在CMV启动子之下、两个核酶之间的全长cDNA可以在真核细胞RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于核酶的自身催化功能，可以保证转录产物的3'末端与病毒基因组精确一致。1.7表达EGFP重组基因组全长cDNA克隆的构建为了救获表达EGFP基因的重组LEP病毒，在病毒基因组转录质粒pCI-LEP的基础上，利用两对引物F2-PF和PmeI-PR，F2-PR和PmeI-PF，通过PCR方法在LEPcDNA第4906nt后引入PmeI限制性酶切位点(GTTTAAAC)。获得的两个PCR片段通过PmeI连接成一个完整的片段，并利用该片段两端的酶切位点(同F2段)替换pCI-LEP上的F2段，从而构建成重组基因组转录载体pCI-LEP-Pmel(见图2a);再以pIRES-EGFP(Clonetech)为模板，以EGFP-PF和EGFP-PR为引物,通过PCR，在EGFP的ORF的5'端引入户/^I限制酶识别序列和LEP自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(AGAAAAAAA)及转录起始序列GS(AACATCCCT)，在EGFP的ORF的3'端引入PweI酶切位点识别序列；PCR产物经户weI酶切插入pCI-LEP-PmeI，构建的表达EGFP重组基因组全长cDNA克隆命名为pCI-LEP-EGFP(见图2b)。表3用于构建表达EGFP基因的重组LEP基因组全长cDNA的PCR引物引物名称引物序列_PmeI-PR5'-GACTTGAAGTTTAAACAGGATGACCGGCCTTCACAGTCTGGT-3'PmeI-PF5'-GTCATCCTGTTTAAACTTCAAGTCCCGAGGATAACCTCC-3'EGFP-PF5'-ATGCGTTTAAACAGAAAAAAATAACATCCCTCGCC4CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'EGFP-PR5'-GCATGTTTAAACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'_注下划线部分为EGFP基因特异序列，黑体表示酶切位点，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用字符边框表示。1.8辅助质粒系统的构建以已成功构建的pCI-LEP为模板，PCR扩增编码核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA(核苷酸序列分别为SEQIDNOs:5-7，引物序列见表2)，分别克隆在pCAGG质粒的多克隆位点(MCS)(pCAGG质粒图谱见图6a)。在起始密码子前引入Kozak序列(GCCACC)，以增强蛋白表达[3'4];在原有终止密码子后增加一个终止密码子，以有效终止辅助质粒mRNA的转录。构建成的辅助质粒分别命名为pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。1.9病毒拯救由LEP病毒基因组转录质粒pCI-LEP拯救LEP病毒转染前一天，将293T细胞传到35mm6孔板上，在10^DMEM培养基中37°。下培养，当细胞密度达到80%以上时即可进行转染。将上述已构建成功的pCI陽LEP、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L分别以4吗、2昭、l吗、1]ig的量加入到250iLil无血清培养基OPTI-MEM中，混匀；取15^1LipofectamineTM2000溶于250(！1OPTI-MEM中，混匀后在室温静置5分钟；然后将LipofectamineTM2000与转染质粒混合均匀，室温孵育30分钟。在此期间用OPTI-MEM洗涤293T细胞两次，然后每孔加入OPTI-MEMlml，最后将LipofectamineTM2000-质粒混合液50(^l加入细胞培养孔中，置于37。CC02培养箱中培养8小时后，吸弃转染液，加入10XDMEM继续培养。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞。72小时后，在BHK-21细胞上用间接免疫荧光(IFA)检测病毒滴度，简言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清为一抗，相同倍数稀释的小鼠阴性血清为对照，荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗，最后用荧光显微镜观察结果。收获上清液，获救病毒株，获救的病毒株命名为rLEP株。1.10重组病毒的拯救由pCI-LEP-EGFP拯救rLEP-EGFP重组病毒将pCI-LEP-EGFP与三个辅助质粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L按上述1.9的方法共转染293T细胞。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞，48小时后用荧光显微镜观察EGFP在感染细胞的表达情况。阴性对照为荧光显微镜下直接观察空白BHK-21细胞。收获上清液，获救重组病毒株，获救的重组病毒株命名为rLEP-EGFP株。1.11种毒的制备及滴定将获救的病毒在BHK-21细胞上进行扩增，在5XDMEM培养基中，37。C培养72小时，收获上清，制备种毒，存于一70。C。在NA细胞或BHK-21细胞上培养48小时后，以IFA(步骤同1.9)确定病毒滴度。病毒滴度用12病灶形成单位(focusformingunit)FFU表示。1.12病毒生长动力学曲线的测定为测定病毒生长动力学曲线，以M.O丄为0.01分别感染单层NA细胞和BHK-21细胞。感作1小时后，用无菌PBS洗2次后，分别加含0.2%FBS的MEM2ml和2%DMEM2ml于37。C培养。分别于接种后24小时、72小时和120小时取细胞培养液上清，在NA细胞和BHK-21细胞上测定滴度，绘制病毒生长动力学曲线。1.13小鼠半数致死量(LD5。)的测定将rLEP和野生病毒wtLEP用灭菌PBS作10倍倍比稀释至lCr、将l(T410'7的各稀释度分别取30|11，分别脑内接种5只56周龄的Balb/c雌性小鼠。连续观察21天，记录每组小鼠的平均体重变化和死亡情况。利用Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(LD5())[5]。2.结果2.1Flury-LEP株基因组全长cDNA的构建为建立Flmy-LEP株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的三个cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒pCI上连接组装获得了11925nt的完整cDNA克隆，且cDNA片断两端加具有自我催化功能的锤头状核酶和丁肝核酶。构建完成的质粒命名为pCI-LEP。2.2辅助质粒的构建核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)组合形成的核糖核蛋白复合物(RNP)是启动病毒复制必不可少的。将N、P和L基因克隆于pCAGG的MCS，使之在真核启动子CMV的作用下转录mRNA，三种必需蛋白得到瞬时表达，从而启动病毒RNA的复制和转录。2.3从全长cDNA克隆拯救病毒将质粒pCI-LEP及表达RVN、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞。3天后收获细胞及上清，盲传一代后IFA检测是否成功拯救出病毒，结果以RV高免血清为一抗的细胞孔内观察到荧光信号(图3a),以小鼠阴性血清为一抗的细胞孔内观察不到荧光信号(图3b)。结果表明，通过反向遗传技术，利用Flury-LEP疫苗株基因组cDNA克隆成功获得拯救病毒株rLEP。2.4从全长cDNA克隆拯救重组病毒为了评估Flury-LEP疫苗株作为载体表达外源基因的可行性，将pCI-LEP-EGFP与三个辅助质粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L共转染293T细胞。用拯救的重组病毒感染BHK-21，48小时后荧光显微镜下可观察到自发绿色荧光(图4)。结果表明，运用反向遗传操作技术成功地拯救了表达外源基因EGFP的感染性重组病毒株rLEP-EGFP。2.5拯救的Flury-LEP(rLEP)生物学特性的鉴定2.5.1动力学曲线野生型LEP(wtLEP)和拯救的LEP(rLEP)在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动力学曲线如图5所示，rLEP在两种细胞上的的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明从基因组全长cDNA拯救出来的rLEP的生长特性与wtLEP是一致的。2.5.2嗜神经指数狂犬病病毒的体外嗜神经指数是指病毒在NA细胞相对于BHK-21细胞上的感染性比例，嗜神经指数为1即表示病毒在神经表元细胞上感染的能力比在非神经细胞上的高10倍[6]。表4可见wtLEP和rLEP的嗜神经指数均为0.8，没有差异。表4wtLEP和rLEP的体外嗜神经性毒株滴度(ffu/mla)NABHK-21—体外嗜神经指数bwtLEP3.7X1085.3X1070.8rLEP2.0X1083.3X1070.8a同一种毒在NA细胞和BHK-21细胞上的滴度b体外嗜神经指数-log(NA上的滴度)—log(BHK-21上的滴度)2.5.3对小鼠的致病性为了确定wtLEP和rLEP对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒105FFU/30pl。感染wtLEP和rLEP的小鼠表现出麻痹、兴奋、体重减轻等中枢神经系统疾病的临床症状，所有的老鼠在11天内全部死亡。此外，我们测定了wtLEP和rLEP的LD5。，分别为8.8个FFU和2个FFU。结果表明，rLEP与wtLEP对小鼠的致病性没有显著差异。通过以上几项rLEP和wtLEP的生物学特性的测定，可见以基因组全长cDNA克隆获救的rLEP与野生毒株wtLEP在生物学特性上并无显著差异。3.讨论自1994年Conzelmann等[7]第一次从基因组cDNA拯救了狂犬病病毒，至今已成功拯救出的狂犬病病毒株SADB19、Flury-HEP[8]、RC-HL[9〗、SHBRV-18[1Q]、Nishigahaga[11]、Ni-CE[12]。本研究首次构建了弱毒疫苗株Flury-LEP的完整基因组cDNA克隆及其辅助质粒系统，并且成功拯救出子代病毒。该反向遗传系统利用胞内RNA聚合酶II，而无需传统的T7聚合酶系统，因此，理论上可以在任何真核细胞系中拯救出病毒。我们在BHK-21细胞、293T细胞上都成功拯救出病毒，但是拯救效率不一。因为在病毒拯救过程与质粒的转染效率、CMV启动子的活性、核酶的剪切活性、转录的速度和比例、病毒mRNA和基因组RNA的复制、病毒蛋白的翻译、组装和病毒粒子的出芽等都息息相关，与转染细胞的状态也有很大的关系。因此，要提高病毒的拯救效率还需要注意到更多的细节，如全长基因组cDNA质粒和辅助质粒的比例、转染细胞状态等。研究通过反向遗传技术拯救的Flmy-LEP弱毒疫苗株的生物学特性包括在神经细胞NA细胞和非神经细胞BHK-21细胞上的生长动力学曲线、嗜神经指数以及对小鼠的致病性与亲本株Flmy-LEP十分相似。这表明，重组狂犬病病毒rLEP具有作为预防狂犬病的活载体疫苗应用的潜力。因此，本发明构建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统和表达绿色荧光蛋白重组病毒载体可以作为在分子水平研究、构建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平台。许多研究表明，狂犬病毒糖蛋白是主要的致病因子，第333位上的精氨酸(R)或赖氨酸(&)病毒的毒力有很大的决定作用[13'14'15]。利用反向遗传技术或通过单抗筛选发现，将该位点精氨酸(R)或赖氨酸(K)替换为谷氨酰胺、丝氨酸或谷氨酸时病毒毒力显著下降。Takayama-Ito等将Flury-HEP的G蛋白第333位谷氨酰胺突变为精氨酸R后，小鼠脑内接种致死。Flury-LEP在传代过程中已高度致弱，但是G蛋白第333位仍为精氨酸(R)，且小鼠脑内接种能感染致死。将Flury-LEP的G333突变为其它氨基酸，其毒力是否会降低，能降低多少，抑或有其他相关致病位点这些问题都还尚未解答。此外，狂犬病病毒还是一个很好的表达外源蛋白的载体[16]，既可在病毒基因组插入导致病毒减毒和增强免疫反应的外源基因，也可插入额外的G基因以增强免疫原性，或者是从基因组中删除某个完整的病毒基因，使病毒无法繁殖而失去毒力。同时，本发明构建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遗传操作系统也为构建表达犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其它疫病的重组二联活载体疫苗奠定了基础。Flury-LEP弱毒疫苗株反向遗传系统的建立和表达EGFP的重组Flmy-LEP的成功拯救为在分子水平研究狂犬病病毒的致病性提供了一个平台，同时也为开发高效、安全的狂犬疫苗提供了基础。另外，所述表达绿色荧光蛋白重组病毒载体也是构建表达其它外源蛋白的重组病毒载体的基础，由其拯救的表达EGFP的LEP重组病毒rLEP-EGFP可以用于直接观察病毒的增殖状态，分析LEP病毒的扩散和致病性，等等。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。参考文献KoprowskiH,BlackJ，NelsenDJ.Studiesonchick-embryo-adapted-rabiesvirus.VI.Furtherchangesinpathogenicpropertiesfollowingprolongedcultivationinthedevelopingchickembryo,//w聽wo/,1954,72(1》94-106.NeumannG,WhittMA,KawaokaYAdecadeafterthegenerationofanegative-senseRNAvirusfromclonedcDNA-whathavewelearned/(JeM肠/,2002，83(Pt11):2635-62.KozakM.AtleastsixnucleotidesprecedingtheAUGinitiatorcodonenhancetranslationinmammaliancells.J"A/o/5z'o/,1987,196(4》947-50.KretzschmarE,BuonocoreL，SchnellMJ，&a/.High-efficiencyincorporationoffunctionalinfluenzavirusglycoproteinsintorecombinantvesicularstomatitisviruses./Fz>o/，1997,71(8):5982-9.Reed，LJ，Muench，H.Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints,Xm.//;;g，1938，27:493~497.MorimotoK，HooperDC,CarbaughH,a/.Rabiesvirusquasispecies:implicationsforpathogenesis.尸racA^/Jm<i/Sc/1998，95(6》3152-6.[7]SchnellMJ,MebatsionT,'ConzelmannKK.InfectiousrabiesvirusesfromclonedcDNA.五細0/，1994，13(18):4195-203.InoueK，ShojiY，KuraneI，&<a/.AnimprovedmethodforrecoveringrabiesvirusfromclonedcDNA./Wra/她/Zzo成2003，107(2):229-36.[9]ItoN,TakayamaM,YamadaK，aa/.RescueofrabiesvirusfromclonedcDNAandidentificationofthepathogenicity-relatedgene:glycoproteingeneisassociatedwithvirulenceforadultmice./Wra/,2001，75(19):9121-8.[10]FaberM,PulmanausahakulR，NagaoK,Wa/.Identificationofviralgenomicelementsresponsibleforrabiesvirusneuroinvasiveness./VocTVof/爿cac/5W,.2004，101(46):16328-32.YamadaK，ItoN，Takayama-ItoM，Multigenicrelationtotheattenuationofrabiesvirus.M/cra6/o//m羅wo/，2006,50(1):25-32.ShimizuK,ItoN,MitaT，Involvementofnucleoprotein，phosphoprotein,andmatrixproteingenesofrabiesvirusinvirulenceforadultmice.Wniw，2007,123(2):154-60.DietzscholdB,"WunnerWH,WiktorTJ,a/.Characterizationofanantigenicdeterminantoftheglycoproteinthatcorrelateswithpathogenicityofrabiesvirus.7Vo^/爿c^/5Wt/5^，1983，80(l):70-4.TuffereauC,LebloisH,B6n句eanJ，Arginineorlysineinposition333ofERAandCVSglycoproteinisnecessaryforrabiesvirulenceinadultmice,1989,172(1):206-12.Takayama-ItoM,InoueK，ShojiY,AhighlyattenuatedrabiesvirusHEP-Flurystrainrevertstovirulentbysingleaminoacidsubstitutiontoarginineatposition333inglycoprotein.2006，119(2):208-15.MebatsionT，SchnellMJ,CoxJH,Wa/.Highlystableexpressionofaforeigngenefromrabiesvirusvectors./VociV"//^cadSc/t/&4，1996，93(14):7310-4.SEQUENCELISTING〈110〉哈尔滨兽医研究所<120>狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体<130>IB091967<歸7<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉11925〈212>DNA<213〉狂犬病病毒Flury-LEP<400>1acgcttaacaacaaaaccaaagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60cacccctacaatggatgccgacaagattgtgttcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120gaagcccgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaa1803aagccttgtataaccctagggaaagcccccgatttaaacaaagcttacaaatcagtttt240atcaggcatgaatgccgccaaacttgatcctgatgatgtatgctcctacttggcagcagc300aatgcagttctttgaggggacatgtccggaagactggaccagctatggaatcctgattgc360acgaaaaggagac犯gatcaccccagactctctagtggagataaagcgtactgatgtaga420agggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagggaccccactgtctccgaaca480tgcatctttagtcggtcttctcctgagtctgtacagattgagcaaaatatcaggacaaaa540cactggtaactataagacaaacattgcggatagaatagagcagattttcgagacagcccc600ttttgttaagatcgtggaacaccataccctgatgacaactcacaagatgtgtgctaattg660gagtactataccgaacttcagatttttggccggaacctacgacatgtttttctcacggat720cgagcatctgtattcggcaatcagagtgggcacagttgtcaccgcttatgaagactgctc780aggactggtatcgtttacagggttcataaaactatatttcttccacaagaactttgaagaagagacagctgttcctcactcttatttcatgtctccttattcatcaaatgccgtcggtcactatatgggtcaagtcagatctctaaatgcgatgtctgttctagggggctatttggg柳aaggttcttcagagacgagsaagaacttc&cgacgtggcactggcagatgacggaaccgttgaaaccagaagtccagaagctgtctatacgagatcscatatacggagatatgtctcagtattcgccgaatttttaaacaaaacgtattctgccagaaatccatagattgtgtatatccaaaccatcccaagtatgagcaagatctttgtcgatcttgagatggccgaagagactgttgaggctcatctccagggagaacccatagaagttcacctgggcgatgaaaaattgtccaacctgtatcgagaggactVtcagatggatgagggcctggacaatgttggagtccaaatagtcaggatatggtcacagaccgtagaggaaattattccaggaaggtcttcggaggataaatcaacgacaacatccactctttctcagagagaaagagttgcctctggccctccatcccttgsatgagtagaggctgagatcgctcatcagattgcctctcgatcttcaggaatattcttgtataacatagttaaagsggcaaaaaatgtaccgggaatccccctaagatgtgtactgggatgggtgatagtcgaggccgacaagctaagcaaaatatgctaaccgagtcttcgaattcattcccttcgacatgaaaaa犯caggcaacaccactaaaaactgtagggatgaggacacccaaaagcgcagatcaatctcaccgc犯gagaagcaat840agagataaggagaatgtttgagccagggca900tcacttccgttcactaggcttgagtgggaa960tgtgttcaatctcattcactttgttggatg1020aacggttattgctgcatgtgcccctcatga1080ggagttcttcggaaaagggacatttgaaag1140agaatatgaggcggctgaactgacaaagac1200caactccgatgacgaggactacttctccgg1260tcgaatcatgatgaatggaggtcgactgaa1320cagttccaatcatcaagcccgtccaaactc1380gagtgactcataaggagttgaatgacaggg1440tcatgaaaaaaactaacactcctcctttcg1500taatccgagtgcaatcagag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