Sec的应用及抗病毒疫苗佐剂和复合物的制作方法
【专利摘要】本发明属生物制品领域，涉及疫苗佐剂，具体涉及金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcus enterotoxin,SEC2)作为疫苗佐剂和用于制备疫苗复合物的用途及方法。本发明将SEC2作为疫苗佐剂，经实验证实，所述的SEC2可作为口蹄疫疫苗佐剂。本发明利用SEC2作为佐剂，与现有商品疫苗对比，能显著提高抗体滴度和细胞因子IL-4、IFN-γ的表达，更有效地刺激体液免疫和细胞免疫反应。同时本发明的佐剂便于生产、运输、成本低、用于疫苗制备方便、易于推广。
【专利说明】
SEC的应用及抗病毒疫苗佐剂和复合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种疫苗佐剂及其制备方法，涉及一种新型的生物蛋白佐剂及其制备 方法，其主要成分为金黄色葡萄球菌肠毒素 C2,用于不同类型抗原的疫苗制备，用于不同种 偶蹄目动物免疫接种所需疫苗佐剂。
【背景技术】
[0002] 随着抗生素滥用导致越来越严重的问题，和新型耐药细菌和病毒的不断出现，感 染性疾病重新受到医药工作者们的密切重视。在感染性疾病的防控领域，接种疫苗依然是 最有效的手段之一，在这一过程中，佐剂的添加，能够使疫苗复合物诱导机体产生更强的免 疫应答，提高抗体滴度，增强细胞因子的分泌水平，因此佐剂的应用对于增强机体免疫系统 对疫苗抗原的应答，提高疫苗的保护效果至关重要。而传统疫苗中，大都为无佐剂添加或添 加的佐剂诱导免疫应答单一，或其诱导机体产生免疫应答效果不佳，因此已经越来越不能 满足对新型感染性疾病的防治需求，亟需具有更好免疫保护效果的新型佐剂问世。
[0003] 传统佐剂中，仅铝佐剂被应用于人用疫苗，而兽用疫苗中最常用的佐剂为油乳佐 剂。其中铝佐剂免疫机体，以体液免疫应答为主，不能很好的诱导细胞免疫应答，并且在大 部分病毒性感染中，细胞免疫应答发挥了关键性作用；油乳佐剂虽然能够很好的诱导机体 产生体液免疫应答和细胞免疫应答，但其副作用也是显著的，主要是在注射部位常发生肉 芽肿、红肿等现象。
[0004] 金黄色葡萄球菌肠毒素 C2作为一种超抗原能够显著性地提高机体的免疫应答效 果，刺激CD4+T和CD8+T淋巴细胞的大量增殖，促进细胞因子几-2、几-4、TNF- α和IFN- γ 等的分泌。因此SEC2作为疫苗佐剂在提升疫苗抗原免疫应答方面具有很好应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种新型疫苗佐剂，另一个目的在于提供了该新型疫苗 佐剂的制备方法及应用，所述疫苗佐剂为兽用口蹄疫疫苗佐剂。
[0006] 金黄色葡萄球菌肠毒素 C2(SEC2)作为活性成份在制备抗病毒疫苗佐剂中的应 用。
[0007] 所述的疫苗佐剂采用金黄色葡萄球菌肠毒素 C2为活性成份。
[0008] 所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗。
[0009] 所述的疫苗为DNA苗（NA疫苗所谓的DNA，是编码"外源性抗原"的，举例来说，口 蹄疫的DNA疫苗，其中所表述的DNA就是编码口蹄疫抗原的）、亚单位疫苗或灭活疫苗。 [0010] 所述的疫苗为兽用疫苗。
[0011] -种抗病毒疫苗佐剂复合物，所述的疫苗佐剂复合物的活性成份为金黄色葡萄球 菌肠毒素 C2和灭活病毒。
[0012] 所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗，灭活病毒为口蹄疫灭活病毒。
[0013] 所述的疫苗佐剂复合物的活性成份中SEC2在疫苗复合物中的质量分数为1/3。
[0014] 所述的疫苗佐剂可以应用于各种偶蹄目动物的预防或治疗口蹄疫疫苗。
[0015] 其制备步骤包括：将50微克的SEC2与100微克的口蹄疫灭活病毒混合，溶解于 200微升生理盐水中，配制成最终疫苗。
[0016] 本发明提供了金黄色葡萄球菌肠毒素 C2的新用途，具体涉及SEC2作为疫苗佐剂 和用于制备疫苗复合物中的用途及其制备方法；本发明利用SEC2作为口蹄疫疫苗佐剂，能 显著地增强疫苗免疫效果，显著性地提高抗体滴度和细胞因子IL-4、IFN-γ的分泌水平。
[0017] 本发明将SEC2作为疫苗佐剂，经实验证实，所述的SEC2可以作为疫苗佐剂用于制 备抗病毒疫苗，尤其用于制备口蹄疫疫苗，其中所述的疫苗为DNA疫苗或灭活疫苗。
[0018] 本发明所述的口蹄疫疫苗中，所述的DNA疫苗，可以通过基因工程手段将SEC2表 达基因和病毒抗原基因克隆到大肠杆菌表达系统中，表达出融合蛋白质，提取纯化后确定 其蛋白质浓度，即制备成疫苗。
[0019] 本发明所述的口蹄疫疫苗中，所述的灭活疫苗，可以使用商品疫苗中的抗原成分， 通过检测蛋白质浓度而确定其中灭活病毒含量，再与SEC2佐剂进行配伍而制成疫苗。
[0020] 本发明中所述的口蹄疫疫苗复合物中，口蹄疫灭活病毒含量根据文献报道确定。
[0021] 本发明的疫苗佐剂与现有技术相比，具有以下优点：
[0022] (1)本发明利用金黄色葡萄球菌肠毒素 C2作为口蹄疫疫苗佐剂，可有效地增强口 蹄疫疫苗的免疫应答。
[0023] (2)本发明所用的SEC2作为口蹄疫疫苗佐剂，能显著地提高抗原免疫后的抗体滴 度和细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平，增强免疫应答效果。
[0024] (3)本发明的疫苗佐剂，具有使用方便、便于运输、工艺简单、成本低、免疫效果好、 适用于各种偶蹄目动物和易于推广等优点。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例4中，终浓度分别为Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000 ng/ mL、10000ng/mL 的 SEC2 刺激小鼠的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)的增殖，以MTS染色法检测增殖（横坐标为终浓度为Ing/mL、10ng/mL、IOOng/ mL、1000ng/mL、10000ng/mL的本发明超抗原佐剂SEC2,纵坐标为增殖指数（Proliferation Index，PI)表示刺激小鼠的PBMC增殖能力，PI =实验组吸光值/阴性对照组吸光值）。
[0026] 图2为本发明实施例5中，终浓度分别为Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、 lOOOOng/mL的SEC2刺激小鼠的脾淋巴细胞的增殖，以MTS染色法检测增殖（横坐标为终浓 度为 lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL 的本发明超抗原佐剂 SEC2,纵坐 标为增殖指数）。
[0027] 图3为本发明实施例6中，ELISA法检测免疫后各实验组小鼠血清中细胞因子 IL-4的分泌水平（横坐标为各采血时间点，分别为第一次免疫后的第0天、5天、10天、14 天、28天、42天、56天和70天，纵坐标为血清中IL-4的分泌水平）。
[0028] 图4为本发明实施例6中，ELISA法检测免疫后各实验组小鼠血清中细胞因子 IFN-γ的分泌水平（横坐标为各采血时间点，分别为第一次免疫后的第0天、5天、10天、14 天、28天、42天、56天和70天，纵坐标为血清中IFN- γ的分泌水平）。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 :制备金黄色葡萄球菌肠毒素 C2
[0030] 阳性克隆大肠杆菌及金黄色葡萄球菌肠毒素 C2纯化蛋白由本实验室保存（表达 纯化方法参照徐明恺，张成刚，周亚凤，张先恩.2005.金黄色葡萄球菌肠毒素 C2的基因 克隆、表达及其生物学活性.生物化学与生物物理进展（SCI). 32(3) :275-281)。
[0031] 实施例2 :SEC2免疫BALB/c小鼠
[0032] 35只小鼠（6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司）分 为5组，分别为SEC2给药组、口蹄疫灭活病毒（FMDV Antigen)给药组、SEC2+Antigen给药 组、商品疫苗（猪口蹄疫0型灭活疫苗0/MYA98/BY/2010株，购自中农威特生物科技股份有 限公司）给药组和生理盐水阴性对照组。间隔两周免疫两次，以左后肢肌肉注射，注射剂量 为200 μ L/只。配伍疫苗中SEC2剂量为50 μ g/支，口蹄疫灭活病毒剂量为100 μ g/支。
[0033] 将50微克的SEC2与100微克的口蹄疫灭活病毒混合，溶解于200微升生理盐水 中，配制成最终疫苗。
[0034] 实施例3 :采集血清
[0035] 第一次免疫后的第0天、5天、10天、14天、28天、42天、56天和70天，以小鼠内耻t 采血，血液样品先置于4°C中静置30分钟，以4°C 5000rpm离心10分钟分离血清，血清保存 于-70 °C用于ELISA检测。
[0036] 实施例4 :检测SEC2体外刺激小鼠的PBMC增殖
[0037] 小鼠断头取血，收集血液约10mL，1:1体积比加入稀释液（含RPMI 1640细胞培养 基，购自Hyclone公司），混勾抗凝血，取15mL离心管，加入2mL淋巴细胞分离液（购自达 科为生物技术有限公司）于每支离心管，将稀释过的血液覆盖在分离液上层（保持液面分 界明显），25°C下1500rpm离心30分钟；取中间白膜层即为淋巴细胞层，再加入2mL RPMI 1640培养基于每支离心管，颠倒洗涤。25°C下1000 rpm离心10分钟，收集细胞；每支离心 管内加红细胞裂解液（8. 9g NH4Cl, Ig KHCO3, 37. 2mg Na2EDTA, pH7. 2-7. 4,定容至 1L，过滤 除菌）lmL，同上离心，收集细胞；以含10%胎牛血清（购自Hyclone公司）的RPMI 1640培 养基调整细胞浓度。以IX IO6Cells/孔加入96孔细胞培养板中，再加入SEC2使终浓度为 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。在 CO2浓度为 5%、37°C下培养 48 小 时，MTS (购自Promega公司）染色法检测PBMC增殖。
[0038] 小鼠的PBMC增殖指数如图1所示。
[0039] 实施例5 :检测SEC2体外刺激小鼠的脾淋巴细胞增殖
[0040] 无菌条件下摘取小鼠脾脏，剪碎研磨过200目细胞筛，红细胞裂解液去除红细胞， 再以无血清RPMI 1640清洗获得小鼠的脾淋巴细胞。以含10%胎牛血清的RPMI 1640培 养基调整细胞浓度，以5X IO6ceIls/孔加入96孔细胞培养板中。再加入SEC2使终浓度为 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。在 CO2浓度为 5%、37°C下培养 48 小 时，MTS染色法检测小鼠的脾淋巴细胞增殖。
[0041] 小鼠的脾淋巴细胞增殖指数如图2所示。
[0042] 实施例6 :检测血清中细胞因子E-4和IFN- γ
[0043] 检测细胞因子采用ELISA法检测（小鼠的细胞因子IL-4和IFN- γ的ELISA检测 试剂盒购自达科为生物技术有限公司）。在96孔板上分别设空白孔（空白对照孔不加样品 及酶标试剂，其余步骤相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标板上标准品准确加样50 μ L，待 测样品孔先加样品稀释液40 μ L，然后再加待测样品10 μ L (样品最终稀释度为5倍）。将样 品加于酶标板孔底部，尽量不接触孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37°C孵育30分 钟后，弃去液体，甩干，每孔加满稀释好的洗涤液，静置30秒后弃去洗涤液，如此重复5次， 拍干。再次孵育，后再次洗涤。每孔先加入显色剂A 50 μ L，再加入显色剂B 50 μ L，轻轻震 荡混匀，37°C避光显色10分钟后，每孔加50 yL终止液终止反应，以空白调零，450nm测OD 值（测定应在终止液加入后的15分钟以内）。
[0044] 小鼠细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平如图3、4所示。
[0045] 实施例7 :检测血清中抗体滴度
[0046] ELISA法（0型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽 医研究所）检测抗体滴度
[0047] 1)用包被缓冲液稀释口蹄疫0型兔抗血清至工作浓度，在酶标板上加50 μ L/孔， 振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。
[0048] 2)抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应，稀释血清：在96孔血清/病毒 抗原反应板上，以50 μ L/孔的量用PBST两倍连续稀释被检血清，从1 :4到1 :512。同时稀 释阳性对照血清，从1 :8到1 :1024 ;稀释阴性对照血清，从1 :2到1 :4 ;将病毒抗原用PBST 稀释至工作浓度（1 :12)，以50 μ L/孔的量加入被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔 内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100 μ L/孔稀释至工作浓度的病毒抗原，振荡，2-8°C过夜。 加入等量的病毒抗原后，血清的稀释倍数加倍，变为1 :8到1 :1024。
[0049] 3)用PBST连续洗酶标板5次，在吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体 反应板上按次序转移至酶标板上的相对应孔，50 μ L/孔，封板，37°C温育60分钟。
[0050] 4)同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫0型病毒豚鼠抗血清至 工作浓度（I :1〇〇〇)，加50 μ L/孔，封板，37°C温育60分钟。
[0051] 5)同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物 至工作浓度（1 :500)，加50 μ L/孔，封板，37 °C温育60分钟。
[0052] 6)同上洗板5次，加50 μ L/孔底物溶液（底物溶液务必要加双氧水，每ImL加 10 μ L本试剂盒配备的3%双氧水），37°C温育15分钟。每孔再加50 μ L终止液终止反应， 读取OD492nni值。
[0053] 小鼠抗体滴度如表1所示。
[0054] 表1FMDV各组免疫小鼠血清中抗体滴度（mean土 sd)
[0056] 本发明将SEC2作为疫苗佐剂，经实验证实，所述的SEC2可作为口蹄疫疫苗佐剂。 本发明利用SEC2作为佐剂，与现有商品疫苗对比，能显著提高抗体滴度和细胞因子IL-4、 IFN-γ的表达，更有效地刺激体液免疫和细胞免疫反应。同时本发明的佐剂便于生产、运 输、成本低、用于疫苗制备方便、易于推广。
【主权项】
1. 金黄色葡萄球菌肠毒素 C2作为活性成份在制备抗病毒疫苗佐剂中的应用。2. -种抗病毒疫苗佐剂，其特征在于：所述的疫苗佐剂采用金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 为活性成份。3. 按照权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于：所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗。4. 按权利要求2所述的疫苗佐剂，其特征在于：所述的疫苗为DNA苗、亚单位疫苗或灭 活疫苗。5. 按权利要求2、3或4所述的疫苗佐剂，其特征在于：所述的疫苗为兽用疫苗。6. -种抗病毒疫苗佐剂复合物，其特征在于：所述的疫苗佐剂复合物的活性成份为金 黄色葡萄球菌肠毒素 C2和灭活病毒。7. 按照权利要求6所述的疫苗佐剂复合物，其特征在于：所述的抗病毒疫苗是口蹄疫 疫苗，灭活病毒为口蹄疫灭活病毒。8. 按照权利要求7所述的疫苗佐剂复合物，其特征在于：所述的疫苗佐剂复合物的活 性成份中SEC2在疫苗复合物中的质量分数为1/3。9. 按照权利要求7或8所述的疫苗佐剂复合物，其特征在于：所述的疫苗佐剂可以应 用于各种偶蹄目动物的预防或治疗口蹄疫疫苗。10. 按照权利要求7或8所述的疫苗佐剂复合物，其特征在于：其制备步骤包括：将50 微克的SEC2与100微克的口蹄疫灭活病毒混合，溶解于200微升生理盐水中，配制成最终 疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK105983096SQ201510095597
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月4日
【发明人】徐明恺, 孟北乾, 张惠文, 张成刚
【申请人】中国科学院沈阳应用生态研究所