猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中Cap蛋白解离的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗 中Cap蛋白解离的方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病2型可引起免疫抑制性疾病。该病毒可诱发多种病毒、细菌的混合 感染和继发感染，给养猪业造成巨大的经济损失，对此病的研宄特别是对其疫苗的研宄正 日益受到关注。疫苗作为防控PCV2的主要手段，国内外研宄者正在研宄和开发各种疫苗， 到目前为止，部分疫苗已在临床试验中取得成功，有的已投入应用，其他候选疫苗也正在积 极研宄中。
[0003] 但猪圆环病毒2型亚单位疫苗中的Cap蛋白抗原含量决定了疫苗的品质，因此直 接检测疫苗中Cap抗原含量是疫苗效力检验最常用、最直接的方法之一，但由于猪圆环病 毒2型亚单位疫苗中加入了铝胶佐剂，琼扩试验中直接影响抗原检测的结果。因此，有必要 提供一种铝胶佐剂疫苗中Cap蛋白解离的方法，从而更好的评价疫苗效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种简便、高效的可用于铝胶疫苗中Cap蛋白解离的方法， 从而为猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗的成品疫苗效力检验（蛋白的琼扩效价检测）奠定了 坚实的基础。
[0005] 本发明首先提供一种解离剂，该解离剂为寡聚核苷酸，其核苷酸序列如下：
[0006] 5' -TCGTCGmTGTCGmTGTCGIT-3'(SEQIDNO:l)，每个核苷酸碱基进行硫代 化修饰；
[0007] 上述的解离剂用于将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来；
[0008] 本发明还提供一种将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来的方法，是在疫苗中加 入解离剂，在震荡条件下37°C处理1小时或以上。
[0009] 本发明采用琼扩试验来评价上述方法的解离效果。
[0010] 本发明提供的解离剂能够有效的将猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中的Cap蛋白抗 原解离出来，从而能更准确有效价评价疫苗的效果，为铝胶佐剂疫苗的效检提供了一种很 好的方法。采用本发明的工艺操作简单，对设备要求低，而且样品处理量大。
【具体实施方式】
[0011] 将不同琼扩效价的抗原制备的铝胶佐剂疫苗，通过加入解离剂，摇匀后放入摇床 37°C，200转/分钟，作用1小时，取解离前和解离后的上清进行琼扩试验，通过研宄发现， 解离前琼扩效价均为阴性，解离后琼扩效价与配苗前的琼扩效价有很好的相关性，解离后 抗原琼扩效价比配苗前效价低0?1个滴度。本发明能更好的评价疫苗中的有效的蛋白含 量，能更准确的评价疫苗的效果。
[0012] 本发明所使用的解离剂，是寡聚核苷酸，其序列：5' -T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C *G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T_3'（*表示对每个碱基进行硫代化），分子量为7696. 8,退火温度 为57. 3°C。该解离剂可以人工合成，本发明实施例中的解离剂由大连宝生物工程有限公司 合成。
[0013] 下面结合实施例对本发明进行具体说明。
[0014] 实施例1
[0015] 1不同抗原效价疫苗的制备取灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白液（AGP效价为 1:64)做为制苗抗原，用灭菌生理盐水分别将其稀释成AGP效价为1:16、1: 8、1: 4、1:2和 1:1后，按4份抗原液加1份铝胶佐剂的比例制成PCV2灭活疫苗。
[0016] 2疫苗解离将上述制备的5种疫苗，分别取摇匀的疫苗5ml，加入0.25g解离剂 后，放入设定200r/min的摇床，37°C解离1小时，以5000r/min离心10分钟取上清准备进 行琼扩试验和免疫组化试验。
[0017] 3Cap蛋白琼扩效价测定
[0018] 3. 1pH值 7. 2,0. 01mol/LPBS溶液的配制精密称取NaH2P04 ? 2H20 1. 56g， Na2HP04 ? 12H20 3. 58g，NaCl9. 0g，加蒸馏水400ml充分溶解后，然后加蒸馏水至1000ml， 调pH值至7. 2。
[0019] 3. 2琼脂平板的制备pH值7. 2,0.Olmol/LPBS100ml，加1. 0g琼脂糖，用微波炉 加热至琼脂糖完全溶解。取无菌直径90mm平皿，加入溶解后的琼脂20ml，制成约3mm厚的 琼脂平板，待琼脂完全凝固后，平皿加盖并倒置，2?8°C冷藏备用。
[0020] 3. 3测样用直径4mm，中央孔与外周孔距为4mm的梅花形打孔器打孔，封底。中央 孔加入标准阳性血清，外围孔依次加入倍比稀释的待检Cap蛋白抗原，加液量以不溢出加 样孔为宜，加样完毕后，静置5?10分钟，将平皿轻轻倒置，放入湿盒内置37°C温箱中作用 24?48小时，观察结果。以出现Cap蛋白抗原最高稀释倍数为待检样品的琼扩效价。
[0021] 4疫苗免疫组化试验将这5组疫苗分别免疫14?28日龄健康易感仔猪5头，各 颈部肌肉注射疫苗，2. 0ml/头；对照猪5头，各颈部肌肉注射灭菌生理盐水，2. 0ml/头，隔离 饲养。免后35日，用猪圆环病毒2型FJ株（病毒含量为106 25TCID5(l/ml)检验用毒攻击，每 头滴鼻1.0ml、肌肉注射2. 0ml，隔离饲养。攻毒后28日，剖杀取腹股沟淋巴结，进行免疫组 化检测。免疫猪应至少4头为阴性，对照猪应至少4头为阳性。
[0022] 5解离标准判定解离后的琼扩效价不低于1:2,比解离前的琼扩效价低1个滴度 或滴度未降低判为解离合格。
[0023] 6试验结果
[0024] 6. 1用确立的解离方法对制备的不同抗原效价的PCV疫苗进行解离，并对其解 离前疫苗上清中的Cap抗原琼扩效价和蛋白含量及解离后疫苗上清的Cap抗原琼扩效价 和蛋白含量进行检测，结果为未解离的疫苗上清琼扩效价均为阴性，Cap抗原蛋白含量均 为0ug/ml，解离后抗原琼扩效价为1:2?1:16个滴度，Cap抗原蛋白含量为44.lug/ml? 331. 2ug/ml，解离后琼扩效价比配苗前低0?1个滴度，与蛋白含量检测结果有很好的相关 性，说明此方法可以用于定量检测成品疫苗中抗原量。结果见表1。
[0025] 6.2当解离的抗原琼扩效价不低于1:2时，免疫组化试验结果均4/5及以上阴 性（疫苗的保护率不低于4/5)，说明解离后的抗原琼扩效价与免疫组化试验有很好的相关 性，可以用于疫苗的效力检验。当成品疫苗解离后，上清中Cap抗原蛋白琼扩效价不低于 1:2时判为疫苗合格。结果见表1。
[0026] 表1:解离效果验证试验结果
【主权项】
1. 一种解离剂，其特征在于，所述的解离剂为寡聚核苷酸，其序列为SEQ ID N0:1。
2. 如权利要求1的解离剂，其特征在于，所述的寡聚核苷酸中的核苷酸碱基进行硫代 化修饰。
3. 权利要求1的解离剂在将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来的应用。
4. 一种将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来的方法，其特征在于，所述的方法是在 疫苗中加入权利要求1的解离剂，在震荡条件下37°C处理1小时或以上。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的疫苗为猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫 苗。
6. -种检测猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗效力的方法，其特征在于，所述的方法是先 用权利要求4所述的方法将Cap蛋白从铝胶佐剂疫苗中解离出来，再进行蛋白的琼扩效价 检测。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗，所使用的解离剂的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明提供的解离剂能够有效的将猪圆环病毒2型铝胶佐剂疫苗中的Cap蛋白抗原解离出来，从而能更准确有效价评价疫苗的效果，为铝胶佐剂疫苗的效检提供了一种很好的方法。采用本发明的工艺操作简单，对设备要求低，而且样品处理量大。
【IPC分类】G01N33-68, C12N15-11, C07K14-01
【公开号】CN104531687
【申请号】CN201410742117
【发明人】张恒, 范根成, 杜元钊
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月7日