一种快速提取细菌dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 食品安全一直以来都是社会各界的关注的重大问题，近年来，随着各种食品安全 问题的不断曝光，人们对食品安全的认识也在不断提高。大多疾病的发生都和食品中的致 病微生物有关，而传统的通过增菌、分离培养、生化反应与血清疑集等操作的方法已远远不 能难以满足现代社会快速检测的要求。实时荧光定量PCR法以其特异性强、稳定性好、灵敏 度高、快速准确等优点在食品微生物检测领域得到广泛的应用，模板DNA的提取是其中的 重要步骤之一，如何快速提取DNA模板是提高实时荧光定量PCR法检测速度的关键。
[0003] 目前，DNA提取方法主要包括物理提取法、化学提取法和商用试剂盒等，物理提取 法包括超声法、煮沸法等，超声法对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌破碎率可达97%，但耗时 较长，且强度过于激烈，易使DNA断裂。煮沸法快速、简便，但难以保证DNA充分裂解，影响 检测的灵敏度；化学提取法包括CTAB法和十二烷基磺酸钠（SDS)法等，CTAB法是目前应用 较多的DNA提取方法，操作方法相对成熟，但该法提取DNA操作繁琐、耗时长，且多次转移， DNA易损失，操作过程中还要使用氯仿等有毒溶剂。十二烷基磺酸钠（SDS)法被广泛用于动 植物DNA的提取，但该方法对于多糖含量高的植物提取效果不佳，难以适应多种多样的食 物基质中细菌DNA的提取，且操作繁琐、耗时长，操作过程中使用苯酚、氯仿等有毒溶剂。商 用试剂盒法具有操作简便、结果稳定、高效的特点，但价格昂贵，成本较高。对于革兰氏阳性 细菌，由于其细胞壁较厚，约20?80nm，一般的试剂盒方法中使用溶菌酶处理半个小时以 上才能进行有效的破壁。而溶菌酶需要低温保存，对试剂盒的运输与储存要求较高。因此， 寻找一种简单便捷、经济实惠、低毒低污染的快速提取方法意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的方法。
[0005] 基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种快速提取细菌DNA的方法，通过样品增菌、低速离心使样品与菌液分离、取上 清液加入裂解液、煮沸等步骤可将细菌的DNA分离出来，具体包括以下步骤：
[0007] (1)扩增样品中的细菌数；
[0008] (2)将样品进行低速离心使样品与菌液分离；
[0009] (3)在分离后的上清液中加入5?10%体积分数的裂解液，煮沸lOmin，所述裂解 液为用TE缓冲液配制的TritonX-100和Tween-20的混合液；
[0010] (4)然后高速离心2min，上清即为DNA溶液（_20°C保存备用）。
[0011] 所述裂解液为1 % (体积分数）的TritonX-100和0? 5% (体积分数）的Tween-20 的混合液。
[0012] 所述TE缓冲液为 10mmol/LTris/HCl,lmmol/LEDTA,pH8. 0。
[0013] 所述扩增样品中的细菌数具体是：吸取少量细菌，均匀混在保健食品原料粉末中， 静置lOmin，加入营养肉汤，混合均勾，37°C培养18h。
[0014] 所述保健食品原料粉末为钙粉。
[0015] 每克保健食品原料粉末中加入9ml的营养肉汤。
[0016] 所述低速离心的转速为1000?3000rpm，高速离心的转速为12000?15000rpm。
[0017] 所述细菌包括大肠杆菌（EscherichiaColi)、沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、志贺氏菌（Shigellaflexneri)等所有革兰氏阴性菌和单增李斯特 菌（Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、猪链球菌 (Streptococcussuis)等所有革兰氏阳性菌。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019] (1)本发明采用增菌后低速离心的方法分离食品样品基质与目标菌株，达到减少 食品基质对DNA提取过程干扰的作用。
[0020] (2)本发明适用于所有的细菌的DNA提取，包括革兰氏阳性细菌，其中Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，增加细胞膜的通透性，裂解细胞壁，和 Tween-20 -起能充分裂解细胞。
[0021] (3)本发明在化学裂解的基础上与煮沸法相组合，和化学法相比，操作步骤简单， 所需时间大大减少，可在20分钟内完成DNA提取过程；和物理法相比，DNA裂解更充分；和 试剂盒法相比，不需要溶菌酶的辅助裂解作用，摈弃了苯酚、氯仿等有毒溶剂的使用对环境 友好，却具有相同的灵敏度检出限，经济成本也大大降低。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1中菌株的实时荧光PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限 于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0024] 实施例1
[0025] 1、分别取100yl大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，志贺氏 菌、猪链球菌（菌株全部为华南理工大学轻工与食品学院食品安全检测中心保藏菌）均匀 混在25g由无限极（中国）有限公司保健食品原料钙粉中，静置10min，加入225ml营养肉 汤增菌液，混合均匀，37°C培养18h。
[0026] 2、取150y1到1. 5ml的离心管中，2000g离心lmin，使样品与菌液分离。将上清液 转移至新的离心管中，取100U1上清液，加入10U1裂解液后，煮沸l〇min。15000rpm高速 离心2min，上清即DNA溶液，-20°C保存备用。所述裂解液为1 %的TritonX-100和0? 5% 的Tween-20的混合液，溶剂全部用TE缓冲液配置。
[0027] 3、参考文献得到各种细菌的引物探针，见表1。实时荧光定量PCR采用20yl反应 体系，每 20y1 的PCR反应体系包含 10y1 2xPCR预混液（PremixExTaq(ProbeqPCR))， 0.2yl参比染料（ROXReferenceDyeII)，lylPCR上游引物，lyl下游引物，0.5yl探 针，2yl模板，用DEPC水补齐至20yl，于ABI7500RealTimePCRSystem进行实时荧光 PCR扩增。反应程序：预变性95°Clmin;扩增95°C5s，60°C40s(收集荧光），每个循环收集 一次焚光，共40个循环，焚光基团用FAM标记。
[0028] 4、检测结果如图1所示，待检测的6种菌都显示阳性扩增曲线。
[0029] 表1引物和探针序列
【主权项】
1. 一种快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 扩增样品中的细菌数； (2) 将样品进行低速离心使样品与菌液分离； (3) 在分离后的上清液中加入5?10%体积分数的裂解液，煮沸lOmin，所述裂解液为 用TE缓冲液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液； (4) 然后高速离心2min，上清即为DNA溶液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液为1 %的Triton X-100和 0? 5%的Tween-20的混合液。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增样品中的细菌数具体是： 吸取细菌，均匀混在保健食品原料粉末中，静置lOmin，加入营养肉汤，混合均匀，37°C培养 18h〇
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述保健食品原料粉末为钙粉。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每克保健食品原料粉末中加入9ml的营养 肉汤。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述低速离心的转速为1000? 3000rpm，高速离心的转速为12000?15000rpm。
7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌（Escherichia Coli)、沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes)、 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、志贺氏菌（Shigella flexneri)、猪链球菌 (Streptococcus suis)〇
【专利摘要】本发明公开了一种快速提取细菌DNA的方法，包括以下步骤:(1)扩增样品中的细菌数；(2)将样品进行低速离心使样品与菌液分离；(3)在分离后的上清液中加入5～10％体积分数的裂解液，煮沸10min，所述裂解液为用TE缓冲液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液；(4)然后高速离心2min，上清即为DNA溶液。本发明通过裂解液和煮沸法相结合，能够达到快速提取DNA的目的。本发明具有操作步骤简单、耗时少、DNA裂解更充分、经济成本低等优点，满足现代微生物快速检测的需求。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104531676
【申请号】CN201410764765
【发明人】肖性龙, 胡双芳, 李蓉, 余以刚, 万松华
【申请人】华南理工大学, 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月11日