检测粪便中细菌dna的试剂盒及其在大肠癌诊断中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种检测粪便中细菌DNA的试剂盒及其在大 肠癌的筛查、诊断或辅助诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 大肠癌在所有肿瘤发病率中排名第三。目前对大肠癌的诊断依赖于大肠镜活检。 然而大肠镜活检为有创性检查，并不能大规模地用于人群筛查。理想的肿瘤筛查指标应具 有较高的敏感性和特异性，同时尽可能为无创性检查。近年科研进展提示大肠癌患者和正 常健康人的肠道菌群在分布上有显著差异，肠道菌群可能参与了大肠癌的发生发展。如果 仅用受试者的粪便进行分析，就能确定是否可能患有大肠癌，就能很好地对普通人群进行 筛查，从而做到对大肠癌早发现早治疗。因此，找到一种能无创性筛选诊断大肠癌的方法， 能尽早尽大可能地发现人群中的大肠癌患者，从而极大地增加人群的生存期，降低患者的 治疗费用。目前，已在临床上应用的无创性地筛查大肠癌的方法主要是：1)粪便隐血试验 (F0BT):F0BT是目前最常用的大肠癌筛查方法，也是唯一一个有前瞻性随机对照试验证明 有效的筛查方法。大肠癌组织或者大的腺瘤通常会渗出少量血液，血液进入大便中被排出。 粪便隐血试验就可检测大便中的少量血液成分。但粪便中带有血液为非特异性表现，故 F0BT对本病的诊断并不具有特异性。而且有时单个粪便样本并不能检测到血液。2)血清癌 胚抗原CEA测定：1965年发现血清中检测CEA筛查大肠癌的方法。在大肠癌患者血清中，可以 检测到癌胚抗原CEA，这是一种糖蛋白，常出现于恶性肿瘤患者血清中，并非大肠癌的特异 性相关抗原，故血清CEA测定对本病的诊断不具有特异性。但用放射免疫法测定CEA，做定量 动态观察，对判定大肠癌的手术效果与检测术后复发有一定意义。如大肠癌经手术将肿瘤 完全切除后，血清CEA则逐渐下降；若复发，又可再度升高。然而在浸润性肿瘤中CEA的敏感 性低于35%，它也不能用于检测早期大肠癌，特异性不够，在许多病理中都有CEA水平的升 高。3)最近还发现CA19-9抗原，CA19-9是一种糖蛋白类的肿瘤标记物，在消化道肿瘤患者的 血清中含量明显升高。血清CA-19-9浓度与Duke分期呈正相关，随着分期的升级浓度升高， 因此浓度的大小对于判断大肠癌的预后有临床应用价值。但血清检测CA19-9的阳性率较 低，仅有22.39%，在各Duke分期中，血清与组织中CA19-9的阳性率差异情况与CEA相同。 Duke A~Duke C期中，通过血清检测CA19-9的阳性率均明显低于术后组织，尤其是在Duke A期患者，检测血清CA19-9的结果为阴性。CA19-9对大肠癌的早期诊断价值不高，但对结直 肠的疗效观察和复发监测具有重要临床意义。4)CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞 膜，属于鞘糖脂类标记物，是胰腺和大肠癌的标记物，特异性不够。
【发明内容】
[0003] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种检测粪便中细菌DNA的试剂盒及 其在大肠癌的筛查、诊断或辅助诊断中的应用，技术方案如下：
[0004] 本发明提供了一种检测粪便中细菌DNA的试剂盒，试剂盒包括以16S rDNA的V1-V3 可变区设计并带有5'-454A、B接头-特异引物-3'的通用融合引物
[0005] 27F 57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0006] 533R 57-TTACCGC GGCTGCTGGCAC-37 ,
[0007] 上述试剂盒通过16S rDNA测序得到运算分类单位，可不经过与已知微生物种属的 比对与合并，直接采用贝叶斯DMNB文本算法预测大肠癌。
[0008] 本发明还提供了上述试剂盒在大肠癌的筛查、诊断或辅助诊断中的应用。
[0009] 本发明还提供了一种检测粪便中细菌DNA的试剂盒在大肠癌的筛查、诊断或辅助 诊断中的应用，包括以下步骤：
[0010] 步骤1、提供取自受试者的粪便样品；
[0011] 步骤2、对步骤1中的粪便样品进行粪便细菌基因组抽提；
[0012] 步骤3、以16S rDNA的V1-V3可变区设计并合成带有5'-454A、B接头-特异引物-3' 的通用融合引物
[0013] 27F 57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0014] 533R 57-TTACCGC GGCTGCTGGCAC-37 ,
[0015] 对步骤2中得到的粪便细菌基因组进行PCR扩增并测序获得测序数据；
[0016] 步骤4、优化步骤3中得到的测序数据获得优化序列；
[0017] 步骤5、将步骤4中得到的优化序列进行0TU聚类分析；0TU( Operat ional Taxonomic Units，运算分类单位)是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进 行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志，在生物信息分析 中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌，要了解一个样品测序结果中的菌种、菌 属等数目信息，就需要对序列进行归类操作(cluster)，通过归类操作，将序列按照彼此的 相似性分归为许多小组，一个小组就是一个0TU，根据指定的相似度例如96%、97%或者 98%，对所有序列进行0TU划分并进行生物信息统计分析；
[0018] 步骤6、将步骤5中得到的0TU采用贝叶斯网状算法、贝叶斯DMNB文本算法或随机森 林算法中的一种进行分析；
[0019] 步骤7、由分类器预测受试者是否为大肠癌类别。
[0020] 进一步地，上述步骤3中使用的测序方法为菌类16s测序法或基因组DNA测序法。
[0021] 进一步地，上述步骤4中，将步骤3中得到的测序数据通过初级除杂得到有效序列， 再精确去杂，得到优化序列。
[0022]进一步地，上述步骤5中，按照97%的相似度将优化序列进行0TU聚类分析。
[0023] 进一步地，上述步骤6中，采用贝叶斯DMNB文本算法对步骤5中得到的OUT进行分 析。
[0024]进一步地，对于上述应用中的0TU聚类分析，用分类后未合并的0TU结果比合并后 的0TU结果能更好地预测大肠癌。在0TU聚类之后，会和SILVA数据库对比，某个0TU对应何种 菌，有可能几个0TU如0TU1，0TU188，0TU19657对应的都是同一个菌如具核梭杆菌，合并是指 将这几个0TU都归纳为一个，未合并就是还是按三个变量算。
[0025] 进一步地，大肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
[0026] 本发明的第一方面是基于以往未认识到的事实，即取自普通人群的粪便标本即可 作为大肠癌筛选的样品。更具体地，本发明第一次指出用WEKA平台中的贝叶斯DMNB文本算 法可以很好的预测样品是否为大肠癌类别。更具体地，本发明第一次指出用未合并的οτυ结 果比用合并后的0TU结果能更好地预测是否为大肠癌类别。基于以粪便细菌种类和丰度特 征判断是否为大肠癌类别有若干优点。与目前已应用于临床的无创性筛查大肠癌方法相 比，用粪便细菌种类和丰度特征预测大肠癌的特异性和敏感性远远高于其他方法。我们发 现用贝叶斯DMNB文本算法分析未合并的肠菌0TU数据，其预测大肠癌的AUC高达0.994,远远 高于粪便隐血试验的AUC 0.633。网状贝叶斯和随机森林分类方法的AUC也在0.9以上，高于 粪便隐血试验，但是低于我们所发现的贝叶斯DMNB文本算法。表明用粪便细菌种类和丰度 特征对预测大肠癌有很好的敏感性和特异性。因此，用粪便肠菌基因组测序结果来筛查大 肠癌，可以大大地提高诊断的敏感性和特异性，大大地减少漏诊率，能很好的有助于判断受 试者是否需要进一步的结肠镜检查。
[0027] 以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0028] 图1示出了本发明较优实施例中的测序及统计分析流程图；
[0029]图2示出了贝叶斯网状算法、贝叶斯DMNB文本算法和随机森林算法三种算法预测 人群A(N=141例)里大肠癌类别的准确率，用R0C曲线下面积(AUC)表示；
[0030]图3a示出了用人群A的0TU分类后合并前（未合并）的0TU结果比合并的0TU结果能 更准确地预测大肠癌；图3b示出了贝叶斯DMNB文本算法利用人群A的0TU结果合并前后两组 数据分别预测大肠癌类别的R0C曲线图；AUC的最高值来源于0TU结果合并前的贝叶斯DMNB 文本算法，达到0.994，合并后的AUC为0.943;
[0031]图4示出了贝叶斯网状算法(AUC = 0.93)和随机森林算法(AUC = 0.94)预测人群A 里大肠癌类别的ROC曲线图，粪便隐血试验的准确率作为对照。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
[0033] 1、病人和组织样本
[0034] 1)人群A:上海交通大学医学院附属仁济医院2012年1月1日至2012年7月30日期间 行电子全结肠镜检查及大肠癌手术患者的粪便标本。
[0035] 纳入标准为：
[0036] (1)年龄 2 50岁；
[0037] (2)具有正常的结肠运动节律，排便频率不多于1天2次，不少于2天1次；
[0038] (3)全结肠镜检查由经验丰富的医生按照标准规范操作，且退镜时间充分。
[0039] 排除标准为：
[0040] (1)既往有大肠腺瘤、大肠癌、肠易激综合征（IBS)、溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病 (CD)病史；
[0041 ] (2)既往有消化道手术史，包括胃、胆道、肠道等；
[0042] (3)遗传性大肠癌高危人群，指来自以下多种疾病家系成员：胃肠道肿瘤家族史； 家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)以及P-J综合征等；
[0043 ] (4)伴有心血管系统、内分泌系统、血液系统及免疫系统疾病；
[0044] (5)伴有肝肾功能损害、肝硬化及门脉高压性胃病；
[0045] (6)6个月内应用过抗生素、阿司匹林等非留体抗炎药(NSAIDs)、炎皮质激素类药 物、促胃肠动力药以及调整肠道菌群的药物；
[0046] (7)6个月内接受过系统性的放疗或化疗。
[0047]我们将符合上述条件，经全结肠镜及病理证实为大肠癌者纳入结直肠癌组（CRC 组），而经肠镜证实无明显异常表现者纳入正常对照组(negative control，NC)组。共收集 粪便标本141例，其中包括NC组99例和CRC组42例。
[0048] 2、粪便细菌基因组抽提
[0049]使用OMEGAS便基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Stool DNA Kit):
[0050] (1)称取200mg的玻璃珠 (glass beads)于2ml离心管中，加入200mg奠便样品，再加 入700μ1缓冲液SP1，用最大速度涡旋3~5min，充分溶解样品；
[00511 (2)加入100μΙ DS缓冲液涡旋混和；
[0052] (3) 70 °C水浴锅温育1 Omin，在此期间涡旋2次；
[0053] (4)室温下离心3，000rpmX 3min，取400μ1上清液于一个新的2ml离心管中并加入 500μ1 SP2,涡旋充分混匀；
[0054] (5)冰浴5min，4°C离心，14,000rpmX 3min，转移上清于一个新的2ml离心管中并加 入〇. 7倍体积异丙醇，颠倒混匀20~30次，一20°C放置lh;
[0055] (6)4°C离心，14,000rpmX10m