Ctab法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及其提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用CTAB法提取动物微生物粪便基因组的试剂盒及其提取方法，所述试剂盒主要是通过溶菌酶破碎粪便中的微生物细胞，利用CTAB溶液去除含有的蛋白杂质，同时利用硅基生物磁珠可以特异性吸附核酸的原理，将动物粪便中微生物的基因组吸附出来，本试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动物粪便微生物基因组。
【专利说明】CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及其提取方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂 盒及其提取方法。
【背景技术】
[0002] 动物肠道是一类典型而又独特的环境，过去将粪便微生物作为资源研宄的极少。 动物体在"出生前"是无菌的，在动物出生的过程中及与外界环境的接触中（包括呼吸、食 物摄取等所有的生命活动），有大量微生物进入体内，并由自身的遗传基因和饮食等特性决 定而形成自身特有的稳定的肠道微生物系统。
[0003] 一方面，宿主肠道为肠道微生物提供优越的栖息和繁殖环境。宿主满足了肠道微 生物生长和繁殖所需要的各种生理条件，包括氧气天然的隔绝、充足的营养物质以及适宜 的温度和PH值等。绝大多数生活在肠道内的微生物是专性或兼性厌氧微生物，他们的生 长和繁殖需要自然界中很少见的厌氧环境，肠道生理特性可以为专性和兼性厌氧微生物创 造出所需的厌氧环境。另一方面，肠道微生物及其基因组赋予人类没有必要在自身上进化 的代谢特性，弥补了宿主动物的某些生物学不足。尽管我们对宿主-肠道微生物之间关系 已经有了一定认识，但他们之间具体的相互关系及作用机理，还需要我们倾注更多的努力 和研宄来更加深刻的认识和理解他们，并对他们加以开发利用。
[0004] 当前对肠道微生物菌群的认识，主要是通过选择性培养基获得粪便菌群纯培养物 而取得的，然而近年来随着宏基因组学的发展，利用于16S rRNA基因的免培养分析技术越 来越受重视，利用16S rRNA基因的免培养分析技术进行肠道微生物多样性的分析的前提要 求是要提取到动物粪便的微生物基因组DNA。因此，为了更好地研宄肠道微生物与动物之间 的关系，提供一种提取动物粪便微生物基因组的试剂盒十分有必要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒及 其提取方法，所述试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动物粪便微生物基因组。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组 成：
[0008] 工作液A :由终浓度0· 25-0. 37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175-0. 2mol/L氢氧 化钠组成，pH = 7-8 ;
[0009] 工作液B :由终浓度10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)和终浓度I-IOmmol/ L乙二胺四乙酸（EDTA)组成，pH = 5. 0-8. 0 ;
[0010] 工作液 C : 10-50mg/ml 溶菌酶；
[0011] 工作液 D : 20-50mg/ml 蛋白酶 K ;
[0012] 工作液E :质量浓度10-20 %的十二烷基硫酸钠（SDS);
[0013] 工作液 F :3-8mol/L 氯化钠（NaCl);
[0014] 工作液G :由终浓度0. 14-0. 28mol/L十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)和终浓度 0· 5-lmol/L 氯化钠（NaCl)组成；
[0015] 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0016] 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0017] 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0018] 工作液K :由终浓度4. 3-21. 4mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，终浓度 2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)，终浓度42. 9-85. 7mmol/L Nacl和体积终浓度 60-80 %无水乙醇组成；
[0019] 工作液 L :8-10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 8. 0-9. 0。
[0020] 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品 编号：AK1-G1000。
[0021] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如工作液A :由终浓度 0· 25-0. 37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175-0. 2mol/L氢氧化钠组成，pH = 7-8 ;是指 磷酸二氢钾在工作液A中的浓度为0. 25-0. 37mol/L，氢氧化钠在工作液A中的浓度为 0· 175-0. 2mol/L，工作液 A 的 pH = 7-8〇
[0022] 所述试剂盒的提取方法，包括粪便的前处理、粪便中微生物细胞的裂解、DNA的游 离与杂蛋白的抽除，RNA的吸附以及磁珠法回收微生物基因组，具体步骤如下：
[0023] 1)粪便的前处理：称取0. 3-0. 5g粪便于2ml离心管中，加入l-2ml工作液A振荡 l_2min，3000-5000rpm/min 离心 10_20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/ min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；
[0024] 2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 μ 1工作液B和 50-60 μ 1工作液C，混匀后，37-40°C水浴l_2h，加入65-70 μ 1工作液D和65-70 μ 1工作 液 Ε，混匀后，37-60°C水浴 l_2h ;加入 100-200 μ I Buffer F 和 50-100 μ IBuffer G 溶液， 混匀后，65-80°C水浴 10_20min ;
[0025] 3) DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 μ 1工作液H，振荡器震 荡30_60s后，12000-13000rpm/min离心10_20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加 入与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将二次上清液移 至灭菌的离心管中；
[0026] 4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10-20s 后，室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠； 在含有磁珠的离心管中加入l_2ml Buffer K，打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力 架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100 μ I Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此 溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0027] 本发明采用以上技术方案，所述试剂盒主要是通过溶菌酶破碎粪便中的微生物细 胞，利用CTAB溶液去除含有的蛋白杂质，同时利用硅基生物磁珠可以特异性吸附核酸的原 理，将动物粪便中微生物的基因组吸附出来，所述试剂盒操作方便、快捷，能够快速获得动 物粪便微生物基因组。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为利用本发明试剂盒提取的动物粪便微生物基因组于1%琼脂糖凝胶中的电 泳检测图：
[0029] 泳道1，2是利用本发明试剂盒提取到的动物粪便微生物基因组；
[0030] 泳道 3 为 TAKARA 公司的 DL4500marker。
【具体实施方式】
[0031] 一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组 成：
[0032] 工作液A :由终浓度0· 25-0. 37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175-0. 2mol/L氢氧 化钠组成，pH = 7-8 ;
[0033] 工作液 B :由终浓度 10-20mmol/L Tris 和终浓度 1-lOmmol/L EDTA 组成，pH = 5. O-8. 0 ；
[0034] 工作液 C :10_50mg/ml 溶菌酶；
[0035] 工作液 D : 20-50mg/ml 蛋白酶 K ;
[0036] 工作液E :质量浓度10-20%的SDS ;
[0037] 工作液 F :3-8mol/L NaCl ;
[0038] 工作液 G :由终浓度 0· 14-0. 28mol/L CTAB 和终浓度 0· 5-lmol/L NaCl 组成；
[0039] 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0040] 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0041] 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0042] 工作液 K :由终浓度 4. 3-21. 4mmol/L Tris,终浓度 2. 1-4. 2mmol/L EDTA,终浓度 42. 9-85. 7mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成；
[0043] 工作液 L ：8~1 Ommol /T, Tris, pH = 8. 0-9. 0〇
[0044] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如工作液A :由终浓度 0· 25-0. 37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175-0. 2mol/L氢氧化钠组成，pH = 7-8 ;是指 磷酸二氢钾在工作液A中的浓度为0. 25-0. 37mol/L，氢氧化钠在工作液A中的浓度为 0.175-0. 2mol/L〇
[0045] 所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
[0046] 1)粪便的前处理：称取0. 3-0. 5g粪便于2ml离心管中，加入l-2ml工作液A振荡 l_2min，3000-5000rpm/min 离心 10_20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/ min离心10-20min，弃上清，保留沉淀；
[0047] 2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 μ 1工作液B和 50-60 μ 1工作液C，混匀后，37-40°C水浴l_2h，加入65-70 μ 1工作液D和65-70 μ 1工作 液 Ε，混匀后，37-60°C水浴 l_2h ;加入 100-200 μ I Buffer F 和 50-100 μ IBuffer G 溶液， 混匀后，65-80°C水浴 10-20min ;
[0048] 3) DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 μ 1工作液H，振荡器震 荡30_60s后，12000-13000rpm/min离心10_20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加 入与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将二次上清液移 至灭菌的离心管中；
[0049] 4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10-20s 后，室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠； 在含有磁珠的离心管中加入l_2ml Buffer K，打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力 架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100 μ I Buffer L，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此 溶液即为粪便微生物基因组DNA，于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0050] 实施例1
[0051] 一种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组 成：
[0052] 工作液A :由终浓度0· 25mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175mol/L氢氧化钠组成， pH = 7. 2 ；
[0053] 工作液B :由终浓度10mmol/L Tris和终浓度lmmol/L EDTA组成，pH = 8. 0 ;
[0054] 工作液C :20mg/ml溶菌酶；
[0055] 工作液D :20mg/ml蛋白酶K ;
[0056] 工作液E :质量浓度10%的SDS ;
[0057] 工作液 F :5mol/L NaCl ;
[0058] 工作液G :由终浓度0. 14mol/L CTAB和终浓度0. 5mol/L NaCl组成；
[0059] 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0060] 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0061] 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0062] 工作液 K :由终浓度 8. 6mmol/L Tris,终浓度 3. 4mmol/L EDTA,终浓度 60mmol/L Nacl和体积终浓度70%无水乙醇组成；
[0063] 工作液 L ：8mmol/L Tris, pH = 8. 0〇
[0064] 实施例2
[0065] -种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组 成：
[0066] 工作液A :由终浓度0· 37mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 2mol/L氢氧化钠组成，pH =8 ；
[0067] 工作液 B :由终浓度 20mmol/L Tris 和终浓度 10mmol/L EDTA 组成，pH = 5. 0 ;
[0068] 工作液C :50mg/ml溶菌酶；
[0069] 工作液D :50mg/ml蛋白酶K ;
[0070] 工作液E :质量浓度20%的SDS ;
[0071] 工作液 F :3mol/L NaCl ;
[0072] 工作液G :由终浓度0. 28mol/L CTAB和终浓度lmol/L NaCl组成；
[0073] 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0074] 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0075] 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0076] 工作液K :由终浓度 21. 4mmol/L Tris,终浓度4. 2mmol/L EDTA,终浓度85. 7mmol/ L Nacl和体积终浓度80%无水乙醇组成；
[0077] 工作液 L ： 10mmol/L Tris, pH = 9. 0〇
[0078] 实施例3
[0079] -种CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，所述试剂盒由以下工作液组 成：
[0080] 工作液A :由终浓度0· 25mol/L磷酸二氢钾和终浓度0· 175mol/L氢氧化钠组成， pH = 7 ；
[0081] 工作液B :由终浓度15mmol/L Tris和终浓度5mmol/L EDTA组成，pH = 6. 5 ;
[0082] 工作液C :10mg/ml溶菌酶；
[0083] 工作液D :35mg/ml蛋白酶K ;
[0084] 工作液E :质量浓度15%的SDS ;
[0085] 工作液 F :8mol/L NaCl ;
[0086] 工作液G :由终浓度0· 21mol/L CTAB和终浓度0· 75mol/L NaCl组成；
[0087] 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0088] 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0089] 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0090] 工作液 K :由终浓度 4. 3mmol/L Tris,终浓度 2. lmmol/L EDTA,终浓度 42. 9mmol/ L Nacl和体积终浓度60%无水乙醇组成；
[0091] 工作液 L :9mmol/L Tris，pH = 8. 5。
[0092] 实施例4
[0093] 利用实施例1的试剂盒，提取动物粪便微生物基因组，具体包括以下步骤：
[0094] 所述试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
[0095] 1)粪便的前处理：分别称取两管0. 3g新鲜的狗粪便于2ml离心管中，加入Iml工 作液A振荡lmin，3000rpm/min离心lOmin，转移上清至灭菌的离心管中，10000rpm/min离 心10min，弃上清，保留沉淀；
[0096] 2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450 μ 1工作液B和50 μ 1工作 液C，混匀后，37°C水浴lh，加入65 μ 1工作液D和65 μ 1工作液Ε，混匀后，37°C水浴2h ;加 入 100 μ I Buffer F 和 50 μ I Buffer G 溶液，混匀后，65°C水浴 20min ;
[0097] 3) DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600 μ 1工作液H，振荡器震荡 60s后，13000rpm/min离心10min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液 等体积的工作液I，13000rpm/min离心10min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
[0098] 4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡20s后， 室温下放置5min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含 有磁珠的离心管中加入Iml Buffer K，打匀后室温静置5min，将离心管放在磁力架上，进行 磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50 μ I Buffer L，将离心管放 在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪便 微生物基因组DNA，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0099] 实施例5
[0100] 本发明的提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，其提取方法包括以下步骤：
[0101] 1)粪便的前处理：称取〇.5g新鲜粪便于2ml离心管中，加入2ml工作液A振荡 l_2min，5000rpm/min离心20min，转移上清至灭菌的离心管中，12000rpm/min离心20min， 弃上清，保留沉淀；
[0102] 2)粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入600 μ 1工作液B和60 μ 1工作 液C，混匀后，40°C水浴2h，加入70 μ 1工作液D和70 μ 1工作液Ε，混匀后，60°C水浴Ih ;加 入 200 μ I Buffer F 和 100 μ I Buffer G 溶液，混匀后，80°C水浴 IOmin ;
[0103] 3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入800 μ 1工作液H，振荡器震荡 30s后，12000rpm/min离心20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入与一次上清液 等体积的工作液I，12000rpm/min离心20min，将二次上清液移至灭菌的离心管中；
[0104] 4)磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡IOs后， 室温下放置lOmin，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含 有磁珠的离心管中加入2ml Buffer K，打匀后室温静置lOmin，将离心管放在磁力架上，进 行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入100 μ I Buffer L，将离心管 放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为粪 便微生物基因组DNA，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0105] 利用实施例1的试剂盒，按照实施例4的提取方法提取的动物粪便微生物基因组 DNA于1%琼脂糖凝胶中的电泳检测结果见图1，其中泳道1，2均是利用本发明试剂盒提取 到的动物粪便微生物基因组，泳道3为TAKARA公司的DL4500marker。从图中可以看出本 方法可以较为快速地提取到动物粪便微生物基因组DNA。
[0106] 提取到的动物粪便微生物DNA，其纯度用OD26cimZOD28tlmi比值来衡量，纯度见表1。
[0107] 表1动物粪便微生物DNA的纯度
[0108]
【权利要求】
1. CTAB法提取动物粪便微生物基因组的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由以下工作 液组成： 工作液A :由终浓度0? 25-0. 37 mol/L磷酸二氢钾和终浓度0? 175-0. 2 mol/L氢氧化 钠组成，pH=7-8 ; 工作液B :由终浓度10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷和终浓度l-10mmol/L乙二胺四乙 酸组成，pH=5. 0-8. 0 ; 工作液C :10-50mg/ml溶菌酶； 工作液D :20-50mg/ml蛋白酶K ; 工作液E :质量浓度10-20%的十二烷基硫酸钠； 工作液F :3-8mol/L氯化钠； 工作液G :由终浓度0? 14-0. 28mol/L十六烷基三甲基溴化铵和终浓度0? 5-lmol/ L氯 化钠组成； 工作液H :体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液； 工作液I :体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液； 工作液J :体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠和水 按照体积比1:2混合配置而成； 工作液K :由终浓度4. 3-21. 4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度2. 1-4. 2 mmol/L乙 二胺四乙酸，终浓度42. 9-85. 7 mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成； 工作液L :8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=8. 0-9. 0。
2. 如权利要求1所述试剂盒的提取方法，其特征在于：其包括以下步骤： 1) 粪便的前处理：称取粪便于离心管中，每〇. 3-0. 5g粪便中加入l-2ml工作液A振荡 l_2min，3000-5000rpm/min 离心 10_20min，转移上清至灭菌的离心管中，10000-12000rpm/ min离心10-20min，弃上清，保留沉淀； 2) 粪便中微生物细胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 y 1工作液B和50-60 y 1 工作液C，混匀后，37-40° C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液E， 混匀后，37-60° C 水浴 l-2h ;加入 100-200 y 1 Buffer F 和 50-100 y 1 Buffer G 溶液，混 匀后，65-80° C 水浴 10-20min ; 3. DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 yl工作液H，振荡器震荡 30_60s后，12000-13000rpm/min离心10_20min，将一次上清液移至灭菌的离心管中，加入 与一次上清液等体积的工作液I，12000-13000rpm/min离心10-20min，将二次上清液移至 灭菌的离心管中； 4) 磁珠法回收微生物基因组：加入与二次上清液等体积的Buffer J，震荡10-20s后， 室温下放置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在 含有磁珠的离心管中加入l_2ml Buffer K，打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力架 上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠；在含有磁珠的离心管中加入50-100 yl Buffer L， 将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，经观察，磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶 液即为粪便微生物基因组DNA。
【文档编号】C12N15/10GK104498477SQ201410835993
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】王清水, 余彦 申请人:福建师范大学