一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用，通过自制的PMMoV抗血清(第一抗体)作为主要试剂组装了PMMoV的ID-ELISA检测试剂盒，可应用于辣椒中PMMoV的检测。该试剂盒具体包含阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物PNPP、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液、5块96孔酶标板和使用说明书1份。以待检测抗原如病毒粒体免疫家兔等脊椎动物可在动物体内诱导产生特异性的抗血清(多克隆抗体)，抗血清可特异性识别并与抗原结合，因此可用于检测样品是否含抗原，填补了国内在PMMoV抗血清制备及相应ELISA检测应用方面的空白。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶学、免疫学或生物学【技术领域】，尤其涉及一种PMMoV贵州分离物 ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。 -种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法 与应用
【背景技术】
[0002] 植物病毒病又被称为"植物癌症"，目前没有有效的治疗方法。对植物病毒病快速、 准确的检测有助于病株的早期发现、隔离和销毁，也是植物抗病育种和脱毒苗的培育所必 须的。诊断植物病毒的方法有传统生物学方法、电镜观察法、血清学方法和分子生物学方法 等。
[0003] 血清学方法是检测植物病毒最为常用和有效的手段之一。目前应用最广泛的血清 学检测方法是酶联免疫吸附法（ELISA)和斑点免疫结合测定法（DIBA)，DIBA法操作程序比 ELISA法要简单，但其检测灵敏度低于ELISA法。
[0004] ELISA检测方法的基本原理是：以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。利 用酶标抗体、抗原或次抗原作为一个检测体系，其灵敏度较高，可检测到纳克（ng)水平 的病毒，并且可以减少检测时间，进行大规模样品调查，使常规病毒诊断变得非常容易， 特别适合脱毒苗的检测。目前，应用最多的是双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)和间接 ELISA (ID-ELISA)等方法。
[0005] DAS-ELISA检测法将已知抗体吸附于固相载体，加入待检样品（含相应抗原）与之 结合，温育后洗涤，加入酶标抗体和底物，使抗体/抗原/酶标记抗体复合物与底物反应，呈 现深浅不同的颜色反应。这种方法的优点：专业性强，灵敏度高、应用广泛，在国外已形成商 业化生产。但是DAS-ELISA存在一定的缺点：（1)检测每种病毒都需要制备相应的酶标记 特异性抗体，标记过程比较复杂，对技术和成本要求均高；（2)生产单克隆抗体存在杂交瘤 细胞系的退化和某些杂交瘤细胞系在大鼠腹腔中不能诱生腹水的问题。
[0006] ID-ELISA检测法将待检样品（含相应抗原）吸附于固相载体，加入第一抗体（抗 血清）与之结合，温育后洗涤，加入能识别第一抗体的酶标第二抗体和底物，使抗原/ 一抗 /酶标二抗复合物与底物反应，呈现深浅不同的颜色反应。ID-ELISA的缺点：对病毒检测的 特异性和灵敏度比DAS-ELISA的要低；优点：（1)无需针对每种待检病毒都制备相应的酶标 记特异性抗体，降低成本和时间；（2)抗血清的制备方法容易，来源广泛。
[0007] 目前，国内未见有辣椒轻斑驳病毒（PMMoV)特异性抗血清制备、ELISA检测方法的 建立和相应试剂盒制备的相关文献报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒的制备 方法，尤其是其中PMMoV特异性抗血清的制备方法。
[0010] 本发明的另一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在检测 辣椒PMMoV的检测方面的应用，旨在解决辣椒轻斑驳病毒（PMMoV)的血清学检测尚属空白 的问题。
[0011] 本发明是这样实现的，一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒，包括：阳性对 照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓 冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液以及96孔酶标板；其中，PMMoV特异性抗血清的制备包 括以下具体步骤：
[0012] (1)根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT-PCR引物：
[0013] 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，
[0014] 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA ;
[0015] (2)对感染PMMoV贵州辣椒分离物的组织进行RT-PCR扩增、纯化以及回收，得到 CP基因片段；
[0016] (3)将所述CP基因片段和原核表达载体pET32a(+)以Nco I和EcoR I两种DNA 限制性内切酶进行双酶切处理、片段回收、连接、重组质粒转化大肠杆菌、重组CP蛋白表达 以及重组CP蛋白回收；
[0017] (4)将所述重组CP蛋白作为抗原免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清，免疫后取兔 血，即得到PMMoV特异性抗血清。
[0018] 优选地，所述阳性对照为含PMMoV病毒的辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所 述阴性对照为健康无毒辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述酶标二抗为碱性磷酸酶标 记的羊抗兔抗体溶液。
[0019] 本发明进一步提供了上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在辣椒PMMoV 的检测方面的应用。
[0020] 酶联免疫吸附测定法（ELISA)是检测生物样品中是否含有特定蛋白质（或特定病 毒）的一种常规方法，其准确性和灵敏度都较高。间接ELISA法的基本原理为：将待检样 品中所有蛋白固定（吸附、或包被）在一支持表面上，加入能识别并与待检抗原结合的抗 体（抗血清），样品中若有抗原则抗体（第一抗体）与其结合，再加入能识别第一抗体的酶 标记第二抗体（酶标二抗），最后加入过量的该酶的底物（反应物），则底物在酶的催化下 不断转变为有颜色的产物，最终将抗原存在的信号放大。本发明利用自制的PMMoV抗血清 (第一抗体）作为主要试剂组装了 PMMoV的ID-ELISA检测试剂盒，可应用于辣椒中PMMoV 的检测。该试剂盒具体包含阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物 PNPP、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液、5块96孔酶标 板和使用说明书1份。以待检测抗原如病毒粒体免疫家兔等脊椎动物可在动物体内诱导产 生特异性的抗血清（多克隆抗体），抗血清可特异性识别并与抗原结合，因此可用于检测样 品是否含抗原。
[0021] 与现有技术的不足相比，本发明所具有的有益效果为：
[0022] (1)本发明采用pET32a(+)和BL21 (DE3)原核表达系统，使得所制备的抗原（重组 PMMoV外壳蛋白）是高度可溶的，便于采用亲和层析纯化抗原，同时也保证了抗原的质量。 与通过提纯完整的病毒粒体作为抗原来制备抗血清的方法比较，采用原核表达制备抗原具 有成本低和步骤简单的优点。
[0023] (2)本发明PMMoV特异性抗血清具有高特异性，针对待测病汁液的效价达1:8000。
[0024] (3)本发明的试剂盒可对辣椒样品中的PMMoV检测灵敏度达0. 3 lmg/mL PMMoV病 汁液（即病叶提取液在稀释3200倍后仍可被检测到）；同一样品在一块酶标板上重复测 定，测得结果（〇〇 4(15值）变异系数小于5 % ;同一样品在5块酶标板上重复测定，测得结果 _4(15值）变异系数小于10%;该试剂盒检测结果具有良好的板内和板间重复性；试剂盒提 供完成该ELISA检测所需的几乎所有试剂、缓冲液和说明书，使用者只需按照说明书操作 即可完成检测；在4°C保存，该试剂盒有效期达1年，填补了国内在PMMoV抗血清制备及相 应ELISA检测应用方面的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明实施例中PMMoV CP基因的RT-PCR扩增产物的电泳图；其中，1 : DNAmarker ;2、3 :RT-PCR 产物；
[0026] 图2是本发明实施例中PMMoV CP基因的原核表达产物的检测结果图；其中，1 :蛋 白质分子量标准；2 :含pET32a(+)空载体的大肠杆菌细胞诱导培养后的裂解样品；3 :未诱 导过夜培养的细胞裂解样品；4?10 :IPTG诱导后培养1、3、6、9、12、15和18h后全细胞裂 解样品；
[0027] 图3是本发明实施例中重组PMMoV CP蛋白可溶性分析结果图；其中，1 :全细胞裂 解样；2 :裂解后的上清；3 :裂解后的沉淀；
[0028] 图4是本发明实施例中自制抗血清的Western Blot分析结果图；其中，1 :预染蛋 白分子量标准；2 :IPTG诱导表达PMMoV CP重组菌全细胞样。
【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0030] 实施例1抗原（重组PMMoV CP蛋白）的制备
[0031] 1、PMMoV贵州分离物外壳蛋白基因（CP基因，大小为474bp)的RT-PCR扩增
[0032] (1)根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT-PCR引物：
[0033] 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，
[0034] 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA。
[0035] (2)从感染PMMoV贵州辣椒分离物的新鲜植物叶片中提取总RNA(Trizol试剂提取 法提取）。
[0036] (3)以第⑵步中提取的总RNA为模板，以第⑴步中设计的引物通过一步RT-PCR 法（使用商品化试剂盒"PrimeScript?0ne Step RT-PCR Kit Ver.2"，宝生物大连公司，货 号：RR055A，或其它公司同类产品）扩增获得PMMoV的CP基因，操作按试剂盒说明书进行 (退火温度：50°C)。取lyL RT-PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所示，在 约474bp左右观察到DNA条带。
[0037] 2、PMMoV CP基因原核表达载体的构建（常规分子生物学方法）
[0038] (1)采用"普通产物纯化试剂盒"（北京天根生化科技有限公司，货号：DP204,或其 它公司同类产品）将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，将纯化的CP基因片段和原核表达 载体pET32a(+)(德国Novagen公司）均同时以Nco I和EcoR I两种DNA限制性内切酶进 行双酶切处理（宝生物大连公司，货号：1160A，1040A，或其它公司同类产品），具体操作按 照限制酶说明书进行。
[0039] (2)对CP基因酶切产物和pET32a (+)酶切产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳（常规 分子生物学操作），CP基因酶切产物应该474bp左右有DNA条带，pET32a (+)酶切产物应该 在5,900bp处有DNA条带。用洁净刀片切下这两处胶条并分别放入2支1. 5mL塑料带盖离 心管中，采用"琼脂糖凝胶回收试剂盒"（北京天根生化科技有限公司，货号：DP209,或其它 公司同类产品）对CP基因和pET32a(+)载体进行回收，具体操作按照试剂盒说明书进行。
[0040] ⑶测定上步中回收的CP基因片段和pET32a⑴载体片段的浓度（ng DNA/ μ L)， 并按照3:1的摩尔比（CP: pET32a (+) = 3:1)进行混合，加入T4DNA连接酶（宝生物大连公 司，货号：2011A，或其它公司同类产品）进行连接，具体操作按照连接酶说明书进行。
[0041] (4)用10 μ L上步中的连接反应产物以热激法转化100 μ L大肠杆菌DH5a感受态 细胞（可购自宝生物大连公司、上海生工等多家公司），并将100 μ L转化后的细胞涂于含 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上在37°C培养16h(常规分子生物学操作）。
[0042] (5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100 μ g/mL氨苄青霉 素的LB液体培养基中进行振荡培养16h (37°C，200rpm)。采用菌液PCR的方法对各培养物 进行阳性重组子的筛选（PCR条件：正向引物S · Tag_Fw :5' -GAACGCCAGCACATGGAC ;反向 引物T7Rv :5 ^ -GCTAGTTATTGCTCAGCGGT，退火温度50°C :循环次数：25)(常规分子生物学 操作）。
[0043] (6)对上步检测到含有阳性重组子（pET32a(+)_PMMoVCP)的菌液进行重组质粒 (即pET32a(+)-PMMoVCP)的提取（常规分子生物学操作）。
[0044] 3、PMMoV CP基因的原核表达和表达产物CP蛋白的获得（常规分子生物学方法）
[0045] (1)用1 μ L提取到的重组质粒热激法转化100 μ L大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞（可购自北京天根生化科技有限公司，货号：CB105 ;Novagen公司等），并于含100μ g/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基平板上在37°C培养16h(常规分子生物学操作）。
[0046] (2)从上述平板上挑取任一单菌落转入5mL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中进行震荡培养16h(37°C，200rpm)，按1:50(V/V)将培养后菌液接种于200mL含 10(^8/11^氨苄青霉素的1^液体培养基中进行震荡培养（371：，200印111)。待细胞培养到对 数生长期，即菌液在600nm的吸光度值（0D_)达0. 5?0. 7时，向菌液中加入异丙基硫代 半乳糖甘（IPTG)使其终浓度达0. 5mmol/L以诱导PMMoV CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)细 胞中的表达，在25°C、200rpm继续振荡培养12h使CP基因表达量（即CP蛋白合成量）达 最大（如图2所示）。可溶性分析表明重组PMMoV CP蛋白是可溶的（如图3所示）。
[0047] (3)将菌液离心，收集菌体，重悬于裂解缓冲液中采用超声方法破碎细胞释放重组 的CP蛋白，离心除去细胞碎片，采用固定化金属亲和层析法（IMAC，镍柱，Ni 2+-NTA)对上清 液中的重组CP蛋白进行纯化，紫外法测定蛋白浓度后备用（常规分子生物学操作）。
[0048] 实施例2
[0049] 1、PMMoV抗血清的制备
[0050] 以实施例1中得到的表达产物即重组CP蛋白（PMMoV病毒的外壳蛋白）作为抗原 免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清。初次免疫使用弗式完全佐剂，加强免疫使用弗式不完 全佐剂。
[0051] 初次免疫：采用背部皮下多点注射的方式对健康的约2kg重的新西兰雄兔进行免 疫，每点约〇. 2?0. 5mL，总量约500 μ g重组CP蛋白。
[0052] 加强免疫：初次免疫后1周，对家兔进行再次免疫，方法如前。每隔一周免疫一次， 总共再次免疫4次。
[0053] 抗血清制备：对家兔进行心脏取血，常规方法制备的血清分装后于_20°C保存待 用。
[0054] 2、PMMoV抗血清质量评价
[0055] Western blot分析表明PMMoV抗血清对重组CP蛋白具有强的特异性（如图4所 示）。采用ID-ELISA法测定，所制备的PMMoV抗血清针对重组CP蛋白的效价（抗血清稀 释度）达1:25600,针对PMMoV病汁液效价达1:8000 ;抗血清在1:1000的稀释度下能检测 到以1:3200倍稀释的PMMoV辣椒病汁液中的PMMoV (即检测灵敏度达0. 3lmg/mL病汁液， 病汁液为新鲜病叶按1:10的研磨提取液）；该抗血清只与PMMoV产生阳性反应，不与同属 的TMV、0RSV和ToMV发生交叉反应，也不与其它能侵染辣椒的病毒如CMV、PVX和PVY发生 交叉反应，具有强的特异性。以上抗血清各项指标完全能够满足对PMMoV病毒的ID-ELISA 检测。
[0056] 实施例3PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒
[0057] 1、PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒包含以下组分：
[0058] (1)阳性对照：将含PMMoV病毒的辣椒叶片冷冻干燥后研磨成细粉并装入小瓶 (lg)。
[0059] (2)阴性对照：将健康无毒辣椒叶片冷冻干燥后研磨成细粉并装入小瓶（lg)。
[0060] (3)A1液：将制备的PMMoV抗血清100 μ L装入小管盖紧（4°C可保存一年）。
[0061] (4)A2液：酶标二抗溶液：碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体溶液（购自碧云天生物技 术研究所，货号：A0239,或其它公司同类产品，4°C保存一年）100 μ L装入小管盖紧。
[0062] (5)显色底物：lg对硝基苯磷酸二钠（ΡΝΡΡ)(购自北京索来宝公司，或其他公司同 类产品）。
[0063] (6) 96孔酶标板5块（购自美国Corning公司，或其它公司同类产品）。
[0064] (7)包被缓冲液：1. 59g碳酸钠，2. 93g碳酸氢钠，0· 20g叠氮化钠，溶于900mL去离 子水，用盐酸调节pH至9. 6,加水至1L。
[0065] (8)PBST洗涤缓冲液：8.0g氯化钠，1. 15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯 化钾，溶于800mL去离子水后调节pH至7. 4,加入0. 5g吐温-20后，加水1L。
[0066] (9)封闭液：脱脂奶粉溶于0. 1MTBST缓冲液至终浓度为5%，完全溶解，过0. 2 μ m 滤膜后4°C保存。
[0067] (10)抗体稀释缓冲液：含2% PVP的PBST缓冲液，4°C保存。
[0068] (11)底物缓冲液：MgCl2 ·6Η200. lg，叠氮化钠0. 2g、乙二醇胺97mL，加800mL去离 子水后用盐酸调节pH至9. 8,定容至1000mL，4°C保存。
[0069] 2、PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒试剂准备
[0070] (1)包被缓冲液：取一袋包被缓冲液（1. 59g碳酸钠，2. 93g碳酸氢钠，0. 20g叠氮 化钠），加水溶解，用盐酸调节pH至9. 6,加水至1L。
[0071] (2)PBST洗涤液：取一袋PBS(8. 0g氯化钠，1. 15g磷酸氢二钠，0· 2g磷酸二氢钾， 〇· 2g氯化钾），加水溶解，调节pH至7. 4,加入一管Tween (吐温）-20,加水至1L。
[0072] (3)抗体稀释缓冲液：取上步配好的PBST洗涤液30mL，加入1袋PVP，溶解。
[0073] (4)封闭液：取30mLPBST洗涤液，加入1. 5g封闭用脱脂奶粉，溶解。
[0074] 3、PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒的应用方法
[0075] (1)阳性对照和阴性对照的预处理：第一次使用本试剂盒时，将阳性对照（带毒叶 片冻干粉末）和阴性对照（健康叶片冻干粉末）打开，各加入l〇mL包被缓冲液，充分重悬 混匀后分装至1. 5mL塑料带盖离心管（每管lmL)，-20°C保存待用。
[0076] (2)待检样品预处理：向0· 5g?lg待检样品中加入5?10mL包被缓冲液（w/v = 1/10)，在研钵中研磨充分。
[0077] 注：可先加少量缓冲液，待研磨细后再加入剩余缓冲液继续研磨，以防叶片飘浮导 致的研磨困难。
[0078] (3)包被：向酶标板孔中加入100 μ L待测样品溶液，每次测定均应同时包被至少 一个孔的阳性对照（100 μ L)、一个空的阴性对照（100 μ L)和一个孔的空白对照（100 μ L 包被缓冲液），建议做一个重复。将酶标板放于湿盒（带盖微波炉饭盒，底部垫上吸水后的 纸）中，4°C孵育过夜，或37°C 2?4h。
[0079] (4)洗涤：将酶标板各孔中的液体倒出，可直接翻转倾倒。用8道或12道排枪向 各孔中加满PBST洗涤缓冲液，放置3min后再次倒掉，此时可将酶标板翻转在吸水纸上进行 拍打尽量除去液体，重复洗涤3次。
[0080] (5)封闭：向每孔加入200 μ L5%脱脂奶粉封闭溶液，37°C湿盒中封闭a。
[0081] (6)洗涤：按步骤"4"方法用PBST洗涤各孔3次。
[0082] (7) -抗孵育：取12 μ L(可做96孔样，可根据具体样品数增减）A1溶液加入到 12mL抗体稀释缓冲液中（1:1000稀释），于加样槽中轻柔混匀（在第"5"步结束前10分钟 内配制），向酶标板各孔中加入100 μ L稀释后的A1溶液，37°C湿盒中孵育lh。
[0083] (8)洗涤：按步骤"4"方法用PBST洗涤各孔8次。
[0084] (9)酶标二抗孵育：将24 μ LA2溶液按1:500比例用抗体稀释缓冲液稀释，于加样 槽中轻柔混匀（在第"7"步结束前10分钟内配制），向酶标板各孔中加入100 μ L稀释后的 Α2溶液，37°C湿盒中孵育lh。
[0085] (10)准备底物溶液：取2片PNPP，加入llmL底物缓冲液溶解（浓度：约lmg/mL， 在第（9)步结束前15分钟内配制），避光保存。
[0086] (11)洗涤：按步骤"4"方法用PBST洗涤酶标板各孔8次。
[0087] (12)底物显色：向各孔中加入现配的PNPP底物溶液，每孔100 μ L，37°C湿盒中显 色lh。
[0088] 4、结果分析：
[0089] (1)通过肉眼观察，阳性对照应为黄色，阴性对照应为无色或浅黄色，空白对照应 为无色，样品孔若为黄色则基本判断为PMMoV阳性，无色则为PMMoV阴性。
[0090] (2)在酶标仪上测定各孔405nm的吸光度值（0D405)，若样品0D405值彡2倍阴性 对照0D405值则判断样品为PMMoV阳性，否则判断为PMMMoV阴性。若阴性对照0D405值小 于0. 05,则阴性对照0D405值均按0. 05计，即样品的0D405值彡2X0. 05才能判定为阳性。
[0091] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0092] _序列表_ SEQUENCE LISTING <110〉贵州师范大学 <120〉一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用 <130〉 2014 <160〉 4 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉正向引物 <400> 1 ctacccatgg catacacagt taccagtg 28 <210〉 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉反向引物 <400> 2 ggaattcagg agttgtagcc cacgtaa 27
[0093] <210〉 3 <211〉 18 <212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <223〉正向引物STag_Fw <400> 3 gaacgccagc acatggac 18 <210〉 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉反向引物T7 Rv <400〉 4 gctagttatt gctcagcggt 20
【权利要求】
1. 一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：阳性对照、阴性对 照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体 稀释缓冲液、底物缓冲液以及96孔酶标板；其中，PMMoV特异性抗血清的制备包括以下具体 步骤： (1) 根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT-PCR引物： 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG， 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA ; (2) 以感染PMMoV贵州辣椒分离物的组织总RNA作为模板，进行RT-PCR扩增、纯化以及 回收，，得到CP基因片段； (3) 将所述CP基因片段和原核表达载体pET32a(+)以Nco I和EcoR I两种DNA限制 性内切酶进行双酶切处理、片段回收、连接、重组质粒转化大肠杆菌、重组CP蛋白表达以及 重组CP蛋白回收； (4) 将所述重组CP蛋白作为抗原免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清，免疫后取兔血，即 得到PMMoV特异性抗血清。
2. 如权利要求1所述的PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳 性对照为含PMMoV病毒的辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述阴性对照为健康无毒辣 椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体溶液。
3. 权利要求2所述的PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在辣椒PMMoV的检测方 面的应用。
【文档编号】G01N33/569GK104101705SQ201410319878
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】乙引, 洪鲲, 万晴姣, 张宇斌 申请人:贵州师范大学