检测待测物的试剂及其方法

专利名称：检测待测物的试剂及其方法
技术领域：
本公开提供了 一种用于检测样品中待测物的含有肝素的试剂以及制 备所述试剂的方法。本公开还提供了用所述试剂检测待测物的方法。
背景技术：
伤寒是一种由伤寒沙门氏菌(^//mweZ/fli^pAO引起的地方性发热疾 病。伤寒症是一个公共健康的关注重点。所述生物体通常通过食用被污染 的食物或水进入体内并穿过肠壁。之后，它进行繁殖并在24-72小时内进 入血流，导致伤寒和菌血症。潜伏10-14天之后，开始出现伤寒的早期症 状如头痛、发热、食欲减退、心动过緩、脾肿大等症状。伤寒在大多数情 况下不致死。发达国家一般采用抗生素如氨千西林、氯霉素、甲氧爷啶-磺胺甲噁唑和环丙沙星来治疗伤寒。及时采用抗生素对所述疾病进行治疗 将病死率降低到约1%。当不进行治疗时，伤寒热会持续三周到一个月。 不进行治疗的病死率为10-30%。伤寒可通过血液培养或检测其抗原或检 测其在血液中的抗体诊断。
通过肥达试验(widal test)诊断存在若干限制。肥达试验不是特异 性的，因为其与其他发热生物体和许多肠杆菌科的生物体都可发生交叉反 应。而且，因为伤寒是一种地方性疾病，因此，在其发病地区总存在一定 背景水平的抗体，这会^J巴达试验得出错误结果。因此，必须为每个地区 确定阈值滴度以排除假阳性的可能性。而且，肥达试验只能在开始发热的 一或两周后才能得到阳性结果。肥达试验是对采样间隔至少 一周的成对血 清样品的试验，因为单次肥达试验是难以理解的和不确定的。
肥达试验的另一限制是在感染早期阶段给予抗生素会抑制抗体的出 现并会因此得到假阴性结果。肥达试验的另一限制是，对于接种了 TAB 疫苗的正常健康人，由于人类系统中存在抗疫苗的循环抗体，因此会得出 假阳性反应结果。肥达试验的另 一 限制是其给出的是伤寒感染的非直接证 据。肥达试验的又一限制是所述试验具有低灵敏度和低特异性。
4其他伤寒诊断的已知技术是基于病原体的分离和鉴定。此方法被称为 黄金法则。在此技术中，通过显微和生化试验从血液中分离出伤寒沙门氏 菌并对其鉴定。然而，此技术具有4艮多限制。上述技术的限制之一是耗时，
因为其需要3-14天的长时间培育并需要完善的实验室设备。上述技术的 另一限制是它的进行需要大量血液样品(10 ml/患者)。上述技术的又一 限制是其需要大量培养基即100 ml (血液样品的10倍)。上述技术的另 一限制是其低灵敏度(40-80%),因为循环中只存在低至1/ml的极少生物 体，itit成了假阴性结果。
上述方法的另一限制是培养细菌的生长被血液中的血清杀菌剂抑制， 这会导致假阴性结果。
血液培养的另一限制是感染早期的抗生素处理可能会抑制培养细菌 的生长，这也会导致假阴性结果。
WO2004047721专利提供了 一种制备用于快速检测伤寒的凝集剂的 方法。WO2007034508提供了 一种检测和/或定量样品中的待测物的超灵 敏方法。
其他已知方法如放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸收试验等基于对 体液中循环抗体的检测，但这些技术具有许多限制。这些技术的限制之一 是它们需要复杂和完善的实验室设备。RIA的另一限制是其需要危害健 康的放射性材料并需要技术人员来处理所M射性材料。上迷技术的另一 限制是试剂非常昂贵。这些技术的另 一 限制是进行这些试验至少需要4-5 小时。大量基于乳胶颗粒的免疫试验用于诊断。抗原的存在经常通过^皮其 抗体包被的颗粒的凝集确定。所述试验对最高达有限浓度的抗原是可靠 的。抗原低于某一浓度时，凝集反应不会发生。所述凝集反应是一种以扩 散为主的过程，因此相当緩慢。为了加快凝集速度和提高试验的灵敏度， 尤其是在皮摩尔和飞摩尔范围的低浓度下，人们尝试了许多技术，其中有 一些在下文有讨论。
非空化驻波超声可迫使抗体包被的颗粒进入压力节点区域从而造成 颗粒碰撞的速度加快，因此已被用于增加不同乳胶凝集试验的灵敏度 (Grundy et al， J of Immunological Methods, vol 165， p 47， (1993)和Ellis et al, J Med. Microbiol., vol 49, p 853， (2000))。小体积液流得到控制的微流 体系统是另 一加强抗原和抗体之间相互作用的方法(Verpoorte， Electrophoresis, vol. 23， p 677， (2002)和Kricka， Clinical Chemistry, vol 44p 2008, (1998))。
共面电场也已被用于形成胶粒链，从而加快乳胶凝集反应的速度 (Song et al， Analytical Chemistry, vol. 66， p. 778， (1994))。
所有上述现有^L术方法都有其内在的限制。例如，在共面场中，所述 颗粒形成了链。在一条链中，相邻颗粒的最大数目为2。换言之，只可能 形成所述颗粒的阵列。因此，即4吏在所述抗体包净皮颗粒上有更多的结合位 点的情况下，也不可能再进一步提高其特异性和灵敏度。微流体系统需要 许多不总是随手可得的精细工程。因此，本领域中需要提供一种方法和系 统，藉此，所述试验的灵敏度得到提高，并且样品中的材料即使在4艮低的 浓度下也可被检出。
然而，很清楚地，本文通过引用的方式纳入的任何文献都没有教导或 公开本发明。

发明内容
本公开提供一种检测样品中待测物的试剂，所述试剂包含肝素和被待 测物配对物包被的基质，其中所述待测物配对物能够与所述待测物结合。
本公开提供了 一种用于检测样品中待测物的方法，所述方法包括用所 述试剂接触所述样品。所述试剂包含肝素和被一种待测物配对物包被的基 质。所述待测物通过所述待测物和所述待测物配对物形成复合物来检测， 所述复合物在下文中称为待测物-待测物配对物复合物。
本公开提供了 一种用于检测样品中待测物的试剂盒，所述试剂盒包含 所述试剂和说明书。
;^&开提供一种用于制备所述试剂的方法，所述试剂包含肝素和祐L待 测物配对物包被的基质，其中所述待测物配对物能够与所述待测物结合。 制备所述试剂的方法包括制备一种基质的悬浮液，用一种待测物配对物 包被所述基质并加入肝素。


图1示出待测物被待测物配对物所附着的基质捕获从而使它们凝集。 图2示出一种用于实施本发明的实验装置。图3示出在存在和不存在电场的情况下待测物(伤寒沙门氏菌抗原) 与被伤寒沙门氏菌特异性抗体包被的基质(乳胶颗粒)的凝集。 图4示出像素强度偏差相对阳性对照浓度的变化。 图5示出使用ELISA检测样品中待测物的本方法的改进方法的图解。 图6示出用于检测和定量样品中待测物的反应装置。
具体实施例方式
本公开提供一种检测样品中待测物的试剂，所述试剂包含肝素和被所 述待测物配对物包被的基质，其中所述待测物配对物能够与所述待测物结 合。
本公开提供一种用于制备所述试剂的方法，所述方法包括制备一种 基质的悬浮液；用一种待测物配对物包被所述基质；并加入肝素。
本公开提供了 一种用于检测样品中待测物的方法，所述方法包括用所 述试剂接触所述样品。所述试剂包含肝素和被一种待测物配对物包被的基 质。所述待测物通过所述待测物和所述待测物配对物形成复合物来检测， 所述复合物在下文中称为待测物-待测物配对物复合物。
本公开提供了一种用于检测样品中待测物的试剂盒，所述试剂盒包含 所述试剂和i兌明书。
抗原(抗体自其生成)即免疫原是一种有时会激发免疫反应的分子。 抗原通常是蛋白或多糖。这包括细菌、病毒和其他微生物的某些部分(外 壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。脂质和核酸只有在与蛋白和多 糖结合时才具有抗原性。非微生物外源(非自身的)抗原可包括花粉、蛋 清以及来自移植组织和器官的蛋白或输入血细胞表面上的蛋白。
在本公开中，术语待测物包括微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原 以及其他外来颗粒。因此，术语待测物也包括抗原。本文所用术语"待测 物"可包括给定样品中希望被检测的任何物质。它可以是抗原、抗体、糖、 半抗原、毒素或任何其他类似物质。在本公开中，术语待测物以抗原伤寒 沙门氏菌抗原为例。
在本公开中，除上下文另有清楚说明的以外，单数形式的"一"、"一 种，，和"该"都包括复数指代对象。因此，例如，提及"一种基质"时包括多 种这样的基质，提及"一种抗体"时指一种或多种抗体或其为本领域技术人员所知的等同物。类似的语法规则也适用于其他例子，如待测物、颗粒、 免疫球蛋白、待测物配对物和分子。
用于检测待测物的"样品，，包括尿液、唾液、血液、滑液、脑脊液和任 何其他天然或合成的生物材料。
所得结果可通过任何可检测信号读取或检测，并采用诸如化学发光、 比色法、放射、反射、荧尤复光、双折射、(在特定波长或波段处的)光 密度变化、透射光吸收度的测量(比浊法)、在前向小角度处的散射光的 测量(称为散射比浊法)、扫描激光显微技术、目测和数字成像等技术观 察。
抗体，也称为免疫球蛋白，是存在于脊推动物的血液或其他体液中的 蛋白，其被免疫系统使用以识别和中和外来物，如称为抗原的细菌和病毒。 在本公开中，术语抗体和免疫球蛋白在下文可交换使用。术语"待测物配 对物"用于代表任何能够识别所述待测物的材料。例如，如杲所述待测物 是一个抗原，则所述待测物配对物可以是一个抗体。"结合伴侣"即基质是 所述待测物配对物通过共价键或非共价键附着的任何颗粒或材料。它包括 乳胶、聚苯乙烯、金、银、钯或任何其他可供所述待测物配对物附着的聚 合或纤维颗粒。
本公开的一个实施方案提供一种检测样品中待测物的试剂，所述试剂 包含被待测物配对物包被的基质，和肝素，其中所述待测物配对物能够与 所述待测物结合。本公开采用肝素来将样品例如血清和血浆样品中的非特 异性反应最小化。
^^开的一个实施方案提供了 一种用于制备所述试剂的方法，所述方
法包括制备一种基质的悬液，用一种待测物配对物包被所述基质，并加 入肝素。
在本公开的另一个实施方案中，所述试剂选自尿液、唾液、血液、滑 液、脑脊液和其他生物材料。
在本公开的另一个实施方案中，所述基质选自乳胶颗粒、金属颗粒、 聚合物颗粒、碳颗粒和硅颗粒。
此外，在本公开的一个实施方案中，所述乳胶颗粒是羧化乳胶颗粒。
在本公开的一个实施方案中，所述乳胶颗粒是大小为0.88-0.卯jim的 羧化乳胶颗粒。
在本公开的另一实施方案中，所述待测物是一种生物大分子。在本公开的另 一实施方案中所提供的所述待测物是一种抗原。 本公开的另一实施方案所提供的所述抗原是伤寒沙门氏菌抗原。 本公开的另 一 实施方案所提供的所述待测物配对物是一种抗体。 本公开的另一实施方案所提供的所述抗原选自微生物、酶、蛋白、糖、
毒素、半抗原和其他外来颗粒。
本公开的另一个实施方案所提供的所述待测物配对物选自蛋白和碳
水化合物。
本公开的另 一个实施方案提供一种检测样品中待测物的方法，所述方 法包括用所述试剂接触所迷样品，并检测待测物和所迷待测物配对物之间 复合物的形成，以下所述复合物称为待测物-待测物配对物复合物。所述 试剂包括被一种待测物配对物包被的基质，和肝素，其中所述待测物配对 物能够与所述待测物结合。
此外，本公开的另一实施方案提供通过检测待测物-待测物配对物复 合物的形成来检测样品中待测物的方法。检测所述待测物-待测物配对物 复合物所采用的检测技术选自化学发光、比色法、放射、反射、荧光发光、 双折射、光密度变化、比浊法、散射比浊法、扫描激光显微技术、目测和 数字成像。
本公开的另 一 实施方案提供了检测样品中待测物的方法，所述方法利 用在与插入所述样品中的电极平面垂直的方向上施加电场。
在本公开的另 一个实施方案中，可检测存在于所述样品中的最低达皮 摩尔浓度的待测物。
本公开的另一实施方案提供了一种用于检测样品中待测物的试剂盒， 所述试剂盒包括试剂和说明书。所述试剂包括肝素和净皮所述待测物配对物 包被的基质，其中所述待测物配对物能够与所述待测物结合。
本公开的另 一实施方案所提供的试剂盒被用于检测待测物，所述待测 物以伤寒沙门氏菌为例。
本公开的另 一实施方案所提供的试剂盒还包括电极、在垂直方向上对 所述样品施加电能的工具和用于检测读出信号的工具。
本公开的另 一 实施方案涉及检测样品中待测物伤寒沙门氏菌抗原的 方法。本公开还提供一种检测样品中目的待测物的高度特异和灵敏的方
法。表5提供了用于检测样品中待测物的凝集反应。
本公开还在Z方向上施加电场以检测样品 待测物。所述电场加强了用于检测待测物(本文以沙门氏菌抗原为例)的凝集反应的灵敏度。
本公开中检测待测物例如伤寒沙门氏菌的方法包括用本公开的试剂 接触待测样品的步骤。所述试剂包括被抗目标待测物的抗体包被的基质， 例如乳胶颗粒。所述试剂还包括肝素。用所述试剂接触所述样品一段充分 的时间以使所述待测物配对物与待测物结合。样品中的待测物与所述待测 物配对物的结合导致待测物-待测物配对物复合物的形成。该复合物导致 反应混合物中形成簇，所述簇随后可被检测到。此外，检测所述待测物-待测物配对物复合物所采用的检测技术选自化学发光、比色法、放射、反 射、荧光发光、双折射、光密度变化、比浊法、散射比浊法、扫描激光显 微技术、目测和数字成像。
本公开中检测待测物例如伤寒沙门氏菌的方法任选地利用在与所述 样品的平面垂直的方向上施加电场以产生可检测信号。施加电场导致可检 测到样品中微量的、不施加电场就检测不到的待测物。施加电场导致可检 测到最低达皮摩尔量的待测物。
本^^开提供一种检测样品中待测物例如伤寒沙门氏菌抗原的高度特 异的方法。样品，例如从临床伤寒疑似患者收集的血清样品，在试验中表 现出非特异性的凝集反应。将肝素加入被待测物配合物包被的乳胶颗粒使 这种非特异性相互作用最小化并使特异性增加数倍。
本公开提供了一种方法，藉此，可检测样品中乃至最少量待测物的存
在。在z方向上(与所述样品的平面垂直)施加电场时，所述待测物和
待测物配对物在电场范围内趋向形成较大的簇，从而可检测出给定样品中 乃至最小量的待测物。
在本公开中，在垂直电场的影响下，所述待测物配对物所附着的基质 发生凝集，因此所述待测物被捕获于所述基质之间。图l显示了所述作用 机理的图解。因为在一个簇中，相邻颗粒的数量更多，因此该方法可更好 地促进待测物与待测物配对物键的形成并因此得到优异的和很高的灵敏 度。
样品中待测物的检测方法可通过若干不同的实施方案实施，例如在z 方向上施加电场。所述电场可通过使用 一种专门针对待测物制备的待测物 配对物来检测出样品中乃至最少量的所述待测物。例如，如果所述待测物 是一个抗原，则制备该抗原的抗体并备用。此后，制备被所述待测物配对
物包被的基质例如聚合材料或乳胶体，然后制备一种包括所述包被材料和样品中待测物的混合物。如此制备的混合物是一种胶体分散液，将其置于
固态表面上(所述表面被一种导体材料预先包被)并对其(在z方向上) 施加一个电场，从而待测物配对物与所述待测物结合，再通过一种合适的 读出信号检测结果。
任选地，未结合的乳胶体和反应溶液可在一段时间后被清洗掉，从而 只留下固定的复合物以观察读出信号。
另 一改进方法可以是ELISA (酶联试验)，其中第一待测物配对物附
着于第一基质。并且提供附着于第二基质的第二待测物配对物和酶。将所 述第一待测物配对物加入样品中， 一段时间后再加入第二待测物配对物，
然后施加充分时间的垂直于所述样品平面的电场以引起所述第一待测物 配对物和第二待测物配对物(带有酶)凝集并产生一个可检测的读出信号。 图5和6显示所述ELISA改进方法的图解。
在一个改进方法中，可将患者的样品收集在小管中，再将附着于所述 基质上的待测物配对物加入该小管中。然后将两个电极浸入所述小瓶中， 使其能有效形成待测物配对物和待测物复合物并给出读出信号。
在前述实施方案中，所施加的电场可以由交流电、直流电或电池供电。
在另一个实施方案中，^^开提供一种可用于检测样品中待测物存在 的装置，所述装置包括一个导电电极和一个电源，还包括一种将电能在垂 直于所述电极的方向上施加到所述电极的工具。图2和6显示所述反应装 置的图解。抗体包被的基质和含有所述待测物的样品夹在两块被导电铟锡 氧化物(ITO) 18包被的玻璃板17之间。所述两板由75 nm厚的绝缘隔离 片隔开，并且此小室被密封以防止所述悬浮液蒸发和流出。 一个与电位计 连接的信号函氣t生器25可用于调节所施加的正弦电压的强度，所述电 压可在万用表16上被读出。与CCD摄像机40连接的偏振光显微镜30 (透射模式)可用于拍摄所述颗粒。观察结果被记录在录^^L45上。所 述装置还具有计算机50，其可以每秒25帧的速度将图像数字化。可通过 分析捕获的图像来定量凝集程度。
在另 一实施方案中，本公开提供用于检测样品中待测物存在的试剂 盒。所述试剂盒会才艮据采用的试验类型而有所变化。然而，通常，所述试 剂盒可包括导电表面以用作电极；用于在垂直于待测物配对物和待测物复 合物的方向上向所述样品施加电能的电源和工具；能够识别样品中与待测 物配对物结合的待测物的待测物配对物，其中所述待测物复合物被包被在基质如乳胶颗粒上；用于检测读出信号的工具；和说明书。
本公开的一个实施方案在实施例1中提供用于检测待测物伤寒沙门氏菌的试剂的制备方法。
在实施例l和2中，本公开的另一实施方案提供在使用和不使用肝素的情况下对样品中待测物即伤寒沙门氏菌抗原的检测。实施例1和2还说明，在检测待测物即伤寒沙门氏菌抗原中对新鲜和存放的试验样品所观察到的凝集不同。实施例2还说明施加垂直于插入所述样品中的电极平面的电场时检测灵敏度加强。在Z方向上施加电场时的凝集反应的强度比不施加电场时要大。
本公开的另一实施方案说明肝素以外的抗凝血剂不会防止导致假阳性信号的非特异性相互作用。实施例3说明，使用肝素以外的抗凝血剂如EDTA和柠檬酸钠检测样品中的待测物时不能防止非特异性相互作用。
4^>开的另 一实施方案说明，由于非特异性相互作用而在新鲜试验样品中观察到的凝集反应导致假阳性结果。因此，要精确检测样品中的待测物，必须防止导致凝集反应的非特异性相互作用以消除假阳性信号。防止非特异性相互作用可通过向被针对目标待测物的待测物配对物包被的基质例如乳胶颗粒中加入肝素来实现。通过使用肝素防止样品中的非特异性相互作用是本公开一个意外的结果。
尽管本发明各个实施方案和/或各个特征已经被说明和描述，但是本领域技术人员明显可知在不偏离本发明精神和范围的情况下还可进行各种其他改变和改动。技术人员还明显可知，前述公开教导的实施方案和特征的全部结合都是可能的，并可产生本公开优选的实施方案。
实施例
给出下面的实施例是为了向本领域普通技术人员就如何制造和使用本发明提供完整的公开和描述，而不是意图限制发明者认定的本发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的所有的和唯一的实验。
实施例l:伤寒沙门氏菌抗原的检测A.伤寒沙门氏菌抗原的抗体的制备
对伤寒沙门氏菌特异的鞭毛蛋白的基因序列使用基因特异引物通过多聚^式反应(PCR)扩增。扩增的PCR产物在有6个组氨酸标签的载体中被克隆并稍后被表达。所表达的蛋白通过Ni-NTA亲和柱色镨纯化。所纯化产物的蛋白含量通过Bradford法测定。在兔中培育此蛋白的超免疫血清。^Jt疫血清的免疫球蛋白部分通过硫酸铵沉淀被分离。所沉淀的免疫球蛋白被悬浮于1.0 ml PB (50 mM， pH 7.2)中，对其进行透析并测定其蛋白含量。
B. 含有乳胶颗粒的悬浮液的制备
取1.0 ml的1%羧化乳胶颗粒和1.0 ml的40 mM MES緩冲液(pH5.8-6.3)置于2.0 ml微量离心管中并在震荡混合器上混合60秒再在4°C下以10000 rpm离心10-12分钟。再将所述乳胶颗粒在2.0 ml 20 mM MES緩沖液(pH 6.1)中通过在震荡混合器上混合60秒再在4。C下以10000 rpm离心10-12分钟洗涤两次。最后一次洗涤后，将所述乳胶颗粒悬浮于1.0 mlMES緩冲液(20 mM， pH 6.1)中并用末端超声机在5瓦特下超声处理60-120秒。稍后逐滴加入1.0 ml新鲜制备的0.1 M 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的MES緩冲液(20 mM， pH 6.1)溶液，同时緩慢震荡该溶液。使所述离心管在20-25。C下以头尾相覆的形式緩慢转动3小时，然后用MES緩冲液(20 mM， pH 6.1)通过在4。C下以10000rpm离心10-12分^l中洗涤3次。然后将所述乳胶颗粒重悬浮于0.7 ml MES緩冲液(20 mM， pH 6.1)中并用末端超声机在5瓦特下超声处理60-120秒。
C. 乳胶试剂的制备
乳胶试剂包含包被有对待测物(在本申请中为伤寒沙门氏菌)特异的抗体的乳胶颗粒和肝素。
将0.6 mg的免疫球蛋白加入到如上制备的此乳胶颗粒悬浮液中并将体积用MES緩沖液(20 mM， pH 6.1)补足到1 mL。然后将此混合物在20-25。C下以头尾相覆的形式緩慢转动18-20小时，以用所述抗体包被所述乳胶颗粒。然后通过加入0.06 ml的1M氨基乙酸(pH ll.O)终止所述包被反应。所述转动在20-25-C下持续30分钟。所述包,皮有抗体的乳胶颗粒通过在4'C下以10000 rpm离心而形成沉淀。用2.0 ml洗'条緩冲液(50mM氨基乙酸，pH 8.5， 0.03% triton X-100和0.05%叠氮化钠)在4'C下以10000 rpm离心10-12分钟将所述沉淀洗涤三次。将包,皮有抗体的经洗涤的乳胶颗粒重悬浮于储存緩冲液中(50 mM氨基乙酸，pH 8.5, 0.03%tritonX-100和0.1。/o叠氮化钠)以获得终浓度为1%的被抗体包被的乳胶，然后将其用末端超声机在5瓦特下超声处理60秒并储存于4°C。将肝素加入到上述储存緩沖液中，使浓度为每ml储存緩冲液50单位。
D. 在所述乳胶试剂中加入测试样品
将20-40 jil (l-2滴)新鲜测试样品、储存测试样品、阳性对照和阴 性对照置于一张玻片上的不同位置。
新鲜测试样品是从受试者获得的并立即对待测物(伤寒沙门氏菌抗 原)的存在进行检测的样品。
储存测试样品是长时间(7天以上)储存在约4°C或更低的低温下的 样品。
将10-20 pl (1-2小滴)所述乳胶试剂加入所述新鲜测试样品和储存 测试样品、阳性和阴性对照中。用不同的木棒将所述反应物小心混合以避 免置于玻片上不同位置的反应物的任何混杂。通过转动玻片l-2分钟使所 述>^应物进一步混合。
E. 特异性测定
用不含肝素的乳胶试剂对上述样品中的抗原进行检测。所有样品都显 示1+级凝集反应。然而，当使用含有肝素的乳胶试剂时，在所有样品中 都未观察到凝集(非特异性反应)。
使用传统伤寒检测方法确认所述结果时，发现新鲜和储存测试样品中 都不含有伤寒沙门氏菌抗原。因此，结论是在新鲜测试样品和阴性对照中 观察到的凝集反应是由于非特异性反应所致。因此，要精确检测样品中的 待测物，必须防止导致凝集反应的非特异性相互作用以消除假阳性信号。 防止非特异性相互作用可通过向被抗伤寒沙门氏菌抗原的抗体包被的乳 胶颗粒的悬浮液中加入肝素来实现。
实施例2:在Z方向上施加电场检测伤寒沙门氏菌抗原 制备伤寒沙门氏菌抗原的抗体、制M有乳胶颗粒的悬浮液、制备乳
胶试剂和向所述乳胶试剂中加入测试样品的步骤如实施例1中所讨论的
进行，
对于在Z方向上施加电场， 一个实验装置的实例示于表2。所述乳胶 颗粒的悬浮液和所述待测物测试样品的混合物夹在两块被导电铟锡氧化 物(ITO)18包被的玻璃板17之间。所述两板由75 pm厚的绝缘隔离片隔 开，并且此小室被密封以防止所述悬浮液蒸发和流出。 一个与电位计连接 的信号函IUL生器25可用于调节所施加的正弦电压的强度，所述电压可在万用表16上被读出。与CCD摄像机40连接的偏振光显微镜30 (透射模式)可用于拍摄所述颗粒。观察结果被记录在录像机45上。所述装置还包括带有黑白影像采集卡PCI-1411 (National Instruments, USA)的计算机50,其可以每秒25帧的速度将图像数字化。可通过分析用此卡捕获的图像来定量凝集程度。为研究电场的影响，将一体积(3 nL)被抗体包,皮的乳胶颗粒与一体积(3 nL)不同稀释度的待测物混合物混合，并将此混合物夹在两块被导电铟锡氧化物(ITO)包被的由75 jim厚的隔离片隔开的玻璃板之间。所述小室用蜡密封以防止水分蒸发。 一个与电位计连接的信号函数发生器用于调节所施加的电场的强度。首先测定在不存在任何抗原时颗粒凝集的电场阈值。在存在抗原时，施加强度为所述电场的大约0.85倍的电场来进行本实验。对施加电场的这一选择可使假阳性信号(没有抗原的情况下发生凝集)最小化，同时使识别的敏感度和速度最大化。本发明人发现最佳电压为1.5 V。为了比较存在和不存在所述电场时的影响，还在不施加任何电场的情况下在相同的条件下进行了实验。用与CCD摄像机和影像釆集卡连接的偏振光显微镜(透射模式，物镜为40 x )对所述颗粒成像。用免费软件ImageJ处理这样获得的影像。应用合适的滤光片，然后调整所述阈值，之后，所述影傳3皮转变为二元影4象，其中所述颗粒/蔟为黑色而背景为白色。然后，使用ImageJ的工具中的创建来计算每簇的平均面积。进行用于检测样品中待测物的凝集反应的反应装置示于图6。图6显示了用两个电极浸在含有所述测试样品的小瓶中，能够有效地进行凝集(伤寒沙门氏菌抗原-抗体复合物的簇形成)反应。然后通过4吏用读出信号工具对所述待测物进行检测和定量。
在对所述反应混合物(测试样品和含有肝素的乳胶颗粒悬浮液)施加电场时，在所述样品中观察到凝集反应。在Z方向上施加电场时凝集的强度比不施加电场时要大。存在和不存在电场时的阳性对照的凝集示于图3。在图3中，左图为不存在电场的情况，右图为存在电场的情况。显示了阳性对照在两个不同浓度下的凝集反应。
此外，通过每簇平均面积的方法对伤寒沙门氏菌抗原的存在进行定量。每簇平均面积相对阳性对照浓度的变化图示于图4。
用不含肝素的乳胶试剂进行上述样品中的抗原检领'J。所有样品都显示1+级凝集反应。然而，在使用含有肝素的乳胶试剂时，在所有的样品中均未观察到凝集反应(非特异性反应)。使用传统伤寒检测方法确认所述结果时，发现新鲜和储存测试样品中 都不含有伤寒沙门氏菌抗原。因此，结论是在新鲜和储存测试样品和阴性
对照中观察到的凝集反应是由于非特异性反应所致。因此，要精确检测样 品中的待测物，必须防止导致凝集反应的非特异性相互作用以消除假阳性 信号。防止非特异性相互作用可通过向被伤寒沙门氏菌抗原包被的乳胶颗 粒的悬浮液中加入肝素来实现。
实施例3:在存在Z方向电场和其他抗凝血剂时新鲜测试样品和储存 测试样品中伤寒沙门氏菌抗原的检测
重复实施例2中提到的步骤。然而，用EDTA代替肝素。用不含肝 素的乳胶试剂在新鲜和储存样品，阳性和阴性对照中进行抗原检测。所有 样品都显示1+级凝集反应。当在用于检测伤寒沙门氏菌抗原的乳胶试剂 中加入EDTA时，在所有样品中都观察到了凝集反应(非特异性反应)。
使用传统伤寒检测方法确认这一结果时，发现新鲜和储存测试样品中 都不含有伤寒沙门氏菌抗原。因此，结论是在新鲜和储存测试样品和阴性 对照中观察到的凝集反应是由于非特异性反应所致。因此，EDTA不能象 肝素一样防止导致凝集的非特异性相互作用。
使用柠檬酸钠代替EDTA进行相同的检测方法。相同的结果表明柠 檬酸钠不能象肝素一样防止导致凝集的非特异性相互作用和假阳性信号。
权利要求
1.一种检测样品中待测物的试剂，所述试剂包含肝素和被待测物配对物包被的基质，其中所述待测物配对物能够与所述待测物结合。
2. 如权利要求l要求的试剂，其中所述样品选自尿液、唾液、血液、滑液、脑脊液和其他生物材料。
3. 如权利要求l要求的试剂，其中所述基质选自乳胶颗粒、金属颗粒、聚合物颗粒、碳颗粒和珪颗粒。
4. 如权利要求3要求的试剂，其中所述乳胶颗粒是大小为0.88-0.90 fim的羧化乳胶颗粒。
5. 如权利要求l要求的试剂，其中所述待测物是一种生物大分子。
6. 如权利要求l要求的试剂，其中所述待测物是一种抗原。
7. 如权利要求6要求的试剂，其中所述抗原是伤寒沙门氏菌(妙A/)抗原o
8. 如权利要求l要求的试剂，其中所述待测物配对物是一种抗体。
9. 如权利要求6要求的试剂，其中所述抗原选自微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原和其他外来颗粒。
10. 如权利要求l要求的试剂，其中所述待测物配对物选自蛋白和碳7JC化合物。
11. 一种检测样品中待测物的方法，所述方法包括用如权利要求l要求的试剂接触所述样品，并检测待测物-待测物配对物复合物的形成。
12. 如权利要求11要求的方法，其中检测所述复合物所采用的检测技术选自化学发光、比色法、放射、反射、荧光发光、双折射、光密度变 化、比浊法、散射比浊法、扫描激光显微技术、目测和数字成像。
13. 如权利要求11要求的方法，还包括在与插入所述样品中的电极平面垂直的方向上施加电场。
14. 如权利要求13要求的方法，可检测所述样品中最低达皮摩尔浓度的待测物。
15. —种用于检测样品中待测物的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1要求的试剂和说明书。
16. 如权利要求15要求的试剂盒，其中所述待测物是伤寒沙门氏菌抗原。
17. 如权利要求15要求的试剂盒，还包含电极、在垂直方向上对所述样品施加电能的工具和用于检测读出信号的工具。
18. —种用于制备如权利要求l要求的所述试剂的方法，所述方法包括(a) 制备一种基质的悬浮液；(b) 用一种待测物配对物包被所述基质；并(c) 将肝素加入上述反应体系。
全文摘要
本公开提供了一种用于检测样品中待测物的试剂以及制备所述试剂的方法。所述试剂包含肝素和被待测物配对物包被的基质。所述试剂的待测物配对物能够与所述待测物结合。本公开还提供一种通过用所述试剂接触所述样品并检测待测物-待测物配对物复合物的形成来检测样品中待测物的方法。本公开还提供一种用于检测样品中待测物的试剂盒。
文档编号G01N33/569GK101680894SQ200880015415
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月13日 优先权日2007年3月14日
发明者A·K·苏德, A·S·尼吉, G·P·雷, G·S·阿加沃, K·瑟卡拉, S·M·P·雷杰 申请人:国防研究与发展组织总干事;印度理学院