专利名称：用于测定患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者中的氨基末端proANP的方法
用于测定患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者中
的氨基末端proANP的方法 本发明涉及用于患有心脏病或怀疑发生或患有心脏病的患者的医学诊断、预后和 治疗随访的体外方法，其包括步骤-提供患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的样品，-使用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体测定所述样品中
的氨基末端proANP或其具有12至98个氨基酸的部分肽，-将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水平归因于临床现象(clinical picture)，其中所述归因是不依赖患者的BMI进行的。 本发明还涉及用于进行本发明方法的快速检验测定法，适合于根据本发明的方法 和测定法的抗体的用途。 心力衰竭(HF)，特别地在急诊科(ED)，是常见的，与高发病率和死亡率相关的，并 且难以诊断的疾病[Cleland， J. G.等人，Eur Heart J，2003.24(5) :p. 442-63 ;Mosterd， A.等人，Heart, 2007. 93(9) :p. 1137-46]。呼吸困难是大多数HF患者的首要症状(leading symptom)。不幸的是，病史和体检都不能准确地区分HF引起的呼吸困难和其他原因例如肺 部疾病引起的呼吸困难[Mueller, C.等人，Can J Cardiol， 2005. 21 (11) :p. 921-4 ;Wang， CS.等人，Jama， 2005. 294(15) :p. 1944-56]。然而，准确的诊断是选择最恰当的治疗所必需 的。 B型利钠肽是已显示在HF的诊断中非常有帮助的HF的定量标志。B型利钠肽 (BNP)和其氨基末端片段N末端B型利钠肽前肽(N-terminalpro-B-type natriuretic p印tide) (NT-proBNP)的使用显著提高了 ED中的诊断准确度[Jan腦i， J. L. ， Jr，等人， Am J Cardiol, 2005. 95(8) :p. 948—54 ;Maisel， A. S.等人，N Engl J Med， 2002. 347 (3): p. 161-7]，从而改善了患者的评价和治疗[Moe， G.W.等人，Circulation, 2007. 115(24): p. 3103-10 ;Mueller， C.等人，N Engl J Med， 2004. 350 (7) :p. 647-54]。
心房利钠肽(ANP)在循环中的浓度是BNP的大约50至100倍[Pandey， K. N.， P印tides，2005. 26(6) :p. 901-32.]。因而，由增加的ANP反映的生物学信号可以在病理生 理上，从而在诊断上甚至比BNP的信号更重要。尽管如此，关于ANP和其前体的诊断性能， 知之甚少[Cowie，M.R.等人，Lancet, 1997. 350 (9088) :p. 1349-53]。成熟的ANP来源于前 体N末端proANP (NT-proANP)，其在循环中显著地比成熟肽更稳定，从而被认为是更可靠的 分析物[Vesely，D丄，IUBMB Life, 2002. 53 (3) :p. 153-9]。然而，由于NT-pro ANP可能经 历进一步片段化的事实[C即pellin，E.等人，Clin Chim Acta, 2001. 310 (1) :p. 49-52]，用 于中间区域proANP (MR-proANP)的测量的免疫测定法可具有优点[Morgenthaler， N. G.等 人，Clin Chem， 2004. 50(1) :p. 234-6]。 心脏病例如慢性心力衰竭(CHF)、急性心力衰竭、急性冠状动脉综合征和心肌梗塞 广泛传播并且通常具有破坏性预后。心脏病的早期诊断可通过及时的保护和治疗措施来提 高医疗成效(patient outcome) [Jortani， SA.等人，Clin Chem 2004;50:265-278]。丰 富的数据暗示利钠肽的测定在验证被怀疑的心脏病的临床诊断和预后中代表了对胸部X
3射线检查、心电图和多普勒超声心动图的有用补充[Cowie， M.R，等人，Eur Heart J2003 ; 24 :1710-1718]。利钠肽家庭的最重要的成员是心房利钠肽(ANP)和B型利钠肽(BNP)。 两者都是心脏功能的标志。除了帮助建立CHF的诊断的用途[Cowie， M.R.等人，Lancet, 1997.350(9088) :p. 1349-53 ;Mueller， C.等人，N Engl J Med， 2004. 350 (7) :p. 647-54] 外，它们还用于患有稳定的或新近失代偿性CHF[Omland， T.等人，Cirulation 1996 ;93 : 1963-1969 ; ， Anand， I. S.等人，Circulation 2003 ;107 :1278-1283 ;Cheng， V.等人， J AmColl Cardiol 2001， 37 :386-391]，或患有急性冠状动脉综合征[Morrow, D. A.等人， JAMA 2005， Dec. 14 ;294(22) :2866-71]的患者的风险归类以及，此外在CHF治疗中用于随 访和指导[Troughton， R. W.等人，Lancet2000， 355 :1126-1130]。 BNP和其前体的其他切割产物N-末端proBNP (NT-proBNP)目前都用于CHF患者的 评估。ANP源于其前体proANP的切割。另一种切割产物N末端proANP (NT-proANP)在循环 中明显比ANP稳定。从而NT-proANP被认为是现有技术中更可靠的分析物[Ala-Kopsala， M.等人，Clin Chem， 2004. 50 (9) :p. 1576-88]。然而，N末端前肽的N和C末端区域可通过 酶促降解而被改变[Seidler，T.等人，Biochem Biophys ResCo匪n 1999,255:495-501]。 通常，认为BNP和NT-proBNP比ANP和NT-proANP更适合于患有心机能不全的患者的诊断 和预后。其理由可能是ANP和NT-proANP的测定被认为重现性不太高，以及大多数应用的 测定设计中的概念性缺陷导致循环分析物的量的部分低估[Yoshibayashi， M.等人，Eur J.Endocrinol 1996 ;135 :265-268 ;Vesely，D. L.等人，IUBMBLife， 2002. 53 (3) :p. 153-9]。
通常，包含激素原(其包含128个氨基酸)(proANP ;SEQ ID NO :2)的C末端部分 的28个氨基酸(99-126)的肽称为实际激素ANP。在ANP从其激素原proANP释放后，等 摩尔量的proANP的剩余的较大部分肽(N末端proANP，由98个氨基酸组成)(NT-proANP ; proANP (1-98))被释放入循环。由于NT-proANP具有显著更长的半衰期和稳定性， NT-proANP因而可用作心脏病的诊断、随访和治疗控制的实验室参数。关于主题的更深入 了角牟，请参考丄othar Thomas (Editor) ， Labor imdDiagnose,第5扩充片反(5th expanded ed. ) ， sub-chapter 2. 14 of chapter 2， Kardiale Diagnostk，第116-118页，禾口其中弓l用 的文献。 为了测定ANP本身以及测定生物液体(血清、血浆、尿)中的NT-proANP ，过去已开 发各种免疫测定法，所述测定法已用于临床研究和实践。大部分用于测定ANP和NT-proANP 的此类免疫测定法基于竞争免疫测定法(其中最广为人知的是放射免疫测定法(RIA))的 已知原理。用于测定proANP和ANP的竞争免疫测定法描述于或用于例如[C即pellin， E.等人，CHn Chim Acta, 2001. 310 (1) :p. 49-52]和[Hiroshi Itoh等人，Journal of Hypertension 1988，6(s聊l 4) S309-S319 ;Meleagros， L等人，；P印tides，第10巻10， 545-550，1989 ;Amir Lerman等人，Lancetl993，341 :1105-09，1993 ;John G F Cleland 等人，Heart 1996,75 :410-413 ;Martin G.Buckley等人，Clinical Science (1999) 97 : 689-695]中。 通过使用识别NT-proANP (NT-proANPl-98 ;SEQ ID NO :1)的各种序列的各种抗 体，利用竞争免疫测定法测定NT-proANP，解释了各种肽出现在生物液体中，特别是血液或 尿中，这相应于NT-proANP (proANP 1-98)的降解产物。特别地，已解释了 ，从NT-proANP 形成了低分子量片段，特别地由于它们的免疫活性而被定位至proANP的氨基酸序列l-30、31-67和79-98的此类片段(参考例如M. G. Buckley等人，ClinicaChimica Acta, 191 (1990) 1-14 ; ， J. B. Hansen等人，Lab. Invest. 1995， 55 :447-452 ;Rose M. Overton等 人，Human Plasma and Serum ;P印tides，第17巻，1155-1162， 1996 ;Sreedevi Daggubati 等人，CardiovascularResearch 36 (1997) 246-255 ;E. F. Macaulay Hunter等人，Scand J CHnI読st 1998 ;58 :205-216 ; ， Martina Franz等人，Kidney International,第58巻 (2000)，374-383， Fumiaki Marumo等人，Human Plasma and Urine ;Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 :231-236(1985)和Engelbert Hartter等人，Clin Chem Lab Med 2000， 38(19) :27-32)。 特异性识别上述序列的竞争免疫测定法总是以相同的方式(无论是基于不同的 抗体亲抗原性的影响还是可能的构象影响)识别全长NT-proANP，从而不能区分NT-proANP 和其片段。 与竞争免疫测定法相反，非竞争性夹心免疫测定法显示许多优点。例如，它们可 更容易被解释为更稳定的固相测定法(异质性测定法(heterogeneous assay))，它们更强 大，以更高的灵敏度提供测量结果，展示较少的交叉反应性以及更适合于自动化和连续的 测量。此外，由于只识别在相同分子中存在的那些结合用于形成夹心的抗体的两个结合部 分的分子和/或肽，因而与只使用一种类型的抗体的竞争免疫测定法相比，夹心免疫测定 法可导致略微不同的结论。如果，例如，结合区域位于不同的部分肽(降解产物、片段)，则 抗体对此类片段的结合将不会导致对于完全"夹心"来说是典型的测量信号。
由于夹心免疫测定法在原理上的已知的优点以及由于只选择性测量完全 NT-proANP而无降解产物和片段的任何影响的可能性，用于测定NT-proANP的夹心免疫测 定法已描述于和应用于临床研究和实践。例如，EP 721 105 Bl描述了使用两种单克隆抗 体特别地在心脏病和慢性肾衰竭的诊断领域中测定proANP的夹心免疫测定法，其中一种 抗体结合proANP的氨基酸1-25 (比较EP 350218 Bl)，而其中另一种抗体结合proANP的氨 基酸43-66。通过进行该类型的夹心免疫测定法，只有这样的proANP部分肽被检测到或在 proANP(1-98)存在的情况下被共检测到，所述部分肽包含proANP序列的至少前66个氨基 酸。 在该方面相似的另一种夹心免疫测定法描述于[Mats Stridsberg等人，J. Med. Sci 102，99-108，第18巻1201-1203]中。该夹心免疫测定法也使用两种单克隆抗体，其中 一种结合proANP的氨基酸1-30，而另一种结合氨基酸79-98。由于proANP的末端(1_98) 上结合区域的选择，可假定该夹心免疫测定法将只检测到完整的proANP (1-98)。
W0 00/19207描述了用于测定proANP(1-98)的方法，其中使用了 3种多克隆抗体 (它们结合proANP(1-98)序列的氨基酸序列8_27、31_64或79-98)中的2种抗体。由W0 00/19207的申请人商业提供的用于测定proANP (1-98)的测定法是酶免疫测定法，其使用 一对亲和纯化的多克隆绵羊抗体，其中被固定的抗体识别proANP的氨基酸10-19，而第二 多克隆抗体用于检测，其识别氨基酸(85-90)(比较由BIOMEDICA， A_1210Wien提供的夹心 测定proANP (1-98)的操作手册)。因此，该测定法也只识别包含全长proANP (1_98)的末端 的肽类别，即完全或几乎完全的NT-proANP 。 现有技术中描述的使用夹心原理的所有竞争测定法已基本上被开发为用于心脏 诊断的测定法或已用于心脏诊断的背景中，其中慢性肾衰竭已被提及为另外的诊断应用
5(比较EP 721 105 Bl和引文[Buckley MG等人，AM. J. Hypertens. 1990 Dec, 3(12 Ptl): 933-935])。 此外，已开发了用于测定proANP的中间区域(氨基酸53_73)的新型夹心免疫 测定法，其测量结果不受肽的假定的末端截断影响[ClinicalChemistry 50， No. 1，2004， pages 234-236]。 本发明的目的是提供用于患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的医学 诊断、预后和治疗随访的体外方法，该方法特别地为急诊科(ED)的医生提供了可靠信息。
因此，本发明包括用于患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的医学诊 断、预后和治疗随访的体外方法，该方法包括步骤-提供患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的样品，-使用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体测定所述样品中
氨基末端proANP或其具有12至98个氨基酸的部分肽，-将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水平归因于临床现象，其中所述归 因是不依赖患者的BMI进行的。 优选，进行根据本发明的体外方法，其中归因于临床现象是借助于不依赖于BMI 的截止值(cut-off value)进行的。 归因于临床现象是指将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水平用于患有 心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的医学诊断、预后或治疗随访，其中所述使用是 不依赖于患者的BMI进行的。 患者的心脏病可选自但不限于慢性心力衰竭、急性心力衰竭、急性冠状动脉综合 征或心肌梗塞。 在本发明的一个实施方案中，疾病被诊断，从而所述方法是用于医学诊断的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，心脏病是心力衰竭。根据本发明的体外方法对 患者来说是特别适合和可靠的，所述患者展示呼吸困难的症状，从而被怀疑患有心力衰竭， 并且对临床现象进行诊断。根据本发明的方法有助于出现在急诊科的患者的评估和管理。 准确的诊断是选择用于此类患者的最恰当治疗所必需的。因此，本发明满足了准确区分心 力衰竭引起的呼吸困难和其他原因例如肺部疾病引起的呼吸困难的需要。因而根据本发明 的方法显著提高了对于心力衰竭的诊断准确性。 已描述了随着健康人群中的BMI不断增加，NT-proANP和BNP的浓度减小[Wang， TJ.等人，Circulation, 2004. 109(5) :p. 594-600]。因而作者推断利钠肽十分不适合用作 肥胖患者的标志("其次，根据调查获得的推测，血浆利钠肽水平对于肥胖个体中的心力衰 竭或左心室功能紊乱来说可能是不太有用的标志。")。 令人惊讶地，在本发明的背景下已发现，对于某些患有心脏病(慢性心力衰竭)的 患者亚群，即具有等于或大于30kg/m2的BMI (体重指数)的亚群体，特别地来源于此类患者 的样品中的氨基末端proANP或来源于其部分肽的测定允许获得可靠的诊断。这正是Wang 等人推断利钠肽在其中可能是不太有用的标志的亚群体。最近的出版物中已描述了 BNP在 住院患者中的患有慢性心力衰竭的肥胖患者亚群中也具有预后价值[Horwich， T.B.等人， J. Am. Coll. Cardiol. 2006， Jan. 3，47(1) :85-90 ;Epub 2005，Dec. 15]。在本发明的背景中， 已令人惊讶地发现，NT-proANP，与BNP类似物NT-proBNP相比较，在所述患者亚群的预后方面更可靠。 在下面，描述了涉及体外方法的本发明的优选实施方案，其中患者或患者群体具 有等于或大于30kg/m2的BMI，并且样品由具有等于或大于30kg/m2的BMI的患者提供。
本发明的一个主题是根据本发明的体外方法，其中患者或患者群体具有等于或大 于30kg/m2的BMI，并且样品由具有等于或大于30kg/m2的BMI的患者提供。
因此，本发明的主题是用于患者的医学诊断、预后和治疗随访的体外方法，所述患 者患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病并且具有等于或大于30kg/m2的BMI ，该方法包括 下列步骤-提供患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病并且具有等于或大于30kg/m2的 BMI的患者的样品，禾口-使用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体测定所述样品中 氨基末端proANP或其部分肽。 根据本发明的方法特别适合于患有慢性心力衰竭的患者的诊断、预后和治疗随 访。 根据本发明的方法特别适合于患有慢性心力衰竭并且具有等于或大于30kg/m2的 BMI的患者的诊断、预后和治疗随访。根据本发明的方法特别适合于患有心脏病或被怀疑发 生或患有心脏病并且具有等于或大于30kg/m2的BMI的患者的诊断、预后和治疗随访，特别 是在其中疾病是慢性心力衰竭的情况下。 在该患者群体即患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病并且具有等于或大于 30kg/m1勺BMI的患者中，特别是在其中疾病是慢性心力衰竭的情况下，优选对有(推测有) 症状的患者进行根据本发明的方法。 在本发明的特别优选实施方案中，具有等于或大于30kg/m2的BMI的患者的死亡 率预后的最佳阈值的范围在190和210pmol/l之间，优选在195和205pmol/l之间，最优选 为199pmol/l。BMI < 30的群体的最佳阈值为231pmol/l。在自然状况下，取决于所使用的测 定法和校准方法，阈值的绝对值可发生变化。本文中提及的阈值通过[Clinical Chemistry 50，No. 1，2004，pages 234-236]中的用于测定结果的相同的测定法和相同的校准方法来估 计。 令人惊讶地，已发现在本发明的方法中，BMI > 30的患者的最佳阈值低于BMI < 30的患者。因此，本发明的主旨特别地是根据本发明的体外方法，其中BMI > 30的患者 的潜在阈值低于BMI < 30的患者。 定义为变异系数的测定的批内分析变异系数(intra-assay variationcoefficient)，其对于来自在一批反应中10次测定的给定测量数值的结果，对 于所有测量值优选至多为10%。超过该值是不利的，因为这可导致测量值相对于阈值的错 误归因，从而可导致错误的结论。 因此，可对具有低于30kg/m2的BMI的患者和对具有高于或等于30kg/m2的BMI 的患者进行根据本发明的体外方法。不依赖于患者的BMI， 190至260pmol/l，优选195至 240pmol/l的阈值适合于根据本发明的方法。然而，在本发明的优选实施方案中，选择具有 等于或大于于30kg/m2的BMI的患者的阈值，以便其范围在190和210pmol/l之间，优选195 和205pmol/l之间，最优选为199pmol/l。 BMI < 30的群体的最佳阈值是231pmol/l。
特别地，由患者提供的样品可以是血浆、血清、血液或尿。 根据本发明，抗体可以是单克隆抗体和多克隆抗体。因此，至少一种抗体是单克隆 或多克隆抗体。 多克隆抗体，特别地亲和纯化 的多克隆抗体是优选的。 根据本发明的方法是特别优选的，其中将横跨氨基酸50至氨基酸90的氨基酸末 端proANP的中间区域用于测定样品中的氨基末端proANP或其部分肽。
在另一个特别优选的实施方案中，使用应用两种抗体的夹心免疫测定法测定样品 中的氨基末端proANP或其部分肽。特别地，如果通过使用特异性结合N末端proANP的不 同的部分序列的两种抗体来测定氨基末端proANP或其部分肽时，这是优选的。
特别优选的是，其中一种抗体通过用包含含有proANP的氨基酸53_72的合成的肽 序列的抗原免疫动物来获得，并且另一种抗体通过用包含含有proANP的氨基酸73-90的合 成的肽序列的抗原免疫动物来获得。在另一个实施方案中，包含proANP的氨基酸53-72的 合成的肽序列具有额外的N末端半胱氨酸基团。在另一个优选实施方案中，另一种抗体通 过用包含含有proANP的氨基酸72-90或73-83以及额外的N末端半胱氨酸基团的合成的 肽序列的抗原免疫动物来获得。通过使用所述合成的肽(一起代表proANP序列的完整的 中间区域部分)获得的抗体从而只识别NT-proANP的氨基酸53-83的范围内的结合区域， 并且可以以多克隆抗体的形式完全检测所述范围。 在根据本发明的体外方法的优选实施方案中，标记其中的一种抗体，并且使第二 抗体结合至固相或可将其选择性地结合至固相。在测定的特别优选实施方案中，标记其中 一种抗体，同时将另一种抗体结合至固相或可将其选择性结合至固相。在优选实施方案中， 按照异质性夹心免疫测定法进行该方法，其中将其中的一种抗体固定在任意选择的固相 上，例如，经涂铺的试管(例如，聚苯乙烯试管；经涂铺的试管；CT)或微量滴定板(例如由 聚苯乙烯构成的)的壁上，或固定至颗粒例如磁性颗粒上，其中另一种抗体具有与可检测 的标记相似或使得能够与标记选择性连接的基团，和用于检测形成的夹心结构。使用适当 的固相，也可以暂时地延迟或随后固定化。 根据本发明的方法还可体现为同质性方法，其中由抗体和待检测的proANP或 proANP部分肽形成的夹心复合物仍然悬浮在液相中。在该情况下，优选地，当使用两种抗体 时，两种抗体都使用检测系统的部分来标记，如果两种抗体都被整合入单个夹心，则这导致 信号的产生或信号的触发。此类技术将特别地体现为荧光增强或荧光猝灭检测方法。特别 优选的实施方案涉及将要配对使用的检测试剂(例如US-A-4882733、 EP-B1 0 180 492或 EP-B1 0 539 477和其中引用的现有技术中描述的检测试剂)的使用。这样，直接在反应混 合物中仅检测在一个免疫复合物中包含两种标记组分的反应产物的测量，成为可能。例如， 以商品名TRACE⑧(Time Resolved Amplified Ciyptate Emission)或KRYPTOR逸提 供执行上述应用的教导的此类技术。 原则上，可使用可用于所述类型的测定的所有标记技术，例如使用放射性同位素、 酶、荧光标记物、化学发光标记物或生物发光标记物或可直接光学检测的颜色标记物例如 金原子和染料颗粒进行的标记，所述标记技术特别地用于定点照护检验(Point-of-Care) (P0C)或快速检测。在异质性夹心免疫测定的情况下，两种抗体都可展示根据本文中在同质 性测定的背景下描述的类型的检测系统的部分。
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在优选的备选测定法中，将第一和第二抗体都分散在液体反应介质中，其中将作 为基于荧光或化学发光猝灭或增强的标记系统的一部分的第一标记组分结合至第一抗体， 并且其中将该标记系统的第二标记组分结合至第二抗体，这样在两种抗体与将要被检测的 氨基末端proANP结合后，产生使得能够检测在测量溶液中形成的夹心复合物的可检测信 号。该备选测定法的一个实施方案包括与荧光或化学发光染料结合的标记系统稀土穴状化 合物(kryptate)或螯合物。在特别优选实施方案中，标记系统包含与荧光或化学发光染料 结合的稀土穴状化合物。 在另外的优选实施方案中，使用竞争免疫测定法进行检测。在特别优选实施方案 中，使用放射免疫测定法。 可与其他标志和/或方法结合来进行根据本发明的方法。这表示可以以多参数诊 断的方式特别有利地进行根据本发明的测量方法。因此，额外地测定至少一种另外的标志， 优选选自炎症标志、心血管标志或局部缺血标志的标志。 在方法的优选实施方案中，炎症标志选自包含下列的组C-反应性蛋白(CRP)、细 胞因子例如TNF-a 、白细胞介素例如IL-6、原降钙素(procalcitonine) (1-116或其部分 肽)和粘附分子例如VCAM或ICAM。 在方法的优选实施方案中，心血管标志选自包含下列的组髓过氧化物 酶、proBNP的完全肽或部分肽、前内皮素-1 (pro-Endothelin-l)、肾上腺髓质素前 体(proAdrenornedullin)、血管力口压素前体(proVasopressine)、胃泌素释放肽前体 (proGRP)、瘦素前体(pro-L印tin)、神经肽Y原(pro-Neurop印tide-Y)、生长抑素原 (pro—Somatostatin)、神经月太YY原、前阿黑皮素(pro—Opionmelanocortin)的至少一禾中标 志。 在方法的优选实施方案中，局部缺血标志选自包含肌钙蛋白I或T、CK-MB、肌红蛋 白(myoglobin)的组的至少一种标志。 因此，可在根据本发明的方法中平行地或同时测定所述标志。在上述多参数测定 中，可设想，例如借助于计算机程序，使用诊断上显著的参数关联性同时或平行地评估许多 参数的测量结果。 在根据本发明的方法中，作为额外的方法，超声心动图或心电图可被记录。 如上面所概述的，患者的心脏病可以是但不限于慢性心力衰竭、急性心力衰竭、急
性冠状动脉综合征或心肌梗塞。 如上所论述的，因而将根据本发明的方法开发为快速检验测定法在本发明的范围 内。 因此，将由患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病并且任选地具有等于或大于 30kg/m2的BMI的患者提供的样品-用于快速检测系统的样品施加区(sample即plication zone),-在反应区中，与至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体接触，
由此-在检测区中，检测与抗体结合的氨基末端proANP或来源于其的部分肽。
优选，快速检测系统可以是微流检测系统。 在另外的优选实施方案中，快速检测系统可以是侧向流动检测装置(lateralflow test device)。该快速检测系统可以是固相侧向流动检测装置。 可在基于免疫迁移(immuno migration)和/或层析的快速检测系统中进行根据
本发明的方法。 因此，本发明的另外的实施方案是在本文中所述的所有实施方案中执行根据本发 明的方法的快速检测系统，用于测定患者的样品中的氨基proANP或其部分肽，所述患者患 有心脏病或或被怀疑发生或患有心脏病并且任选地具有等于或大于30kg/n^的BMI，其中使 用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体。优选，部分序列的长度是至少 12个氨基酸。更优选部分序列的长度是50至98个氨基酸。 因此，本发明的另外的客体是至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列 的抗体在患者的医学诊断、预后和治疗随访中的用途，所述患者被怀疑患有或发生心脏病 和任选地具有等于或大于30kg/m2的BMI。 在下面，通过描述测定患者生物样品中的NT-proANP和NP-proBNP而获得的结果 来更详尽地解释本发明。
实施例 实施例1 [Morgenthaler， N. G.等人，Clin Chem， 2004. 50 (1) :p. 234-6]]中描述的测定法 用于测量氨基末端proANP。按照手册(Elecsys)使用由Roche提供的可商购获得的检测来 测定NT-proBNP。 在患有慢性心力衰竭的患者的血浆样品中测定两个标志。特别地进一步调查体 重指数>=30kg/m2的患者亚群(n = 144)。在这144个患者中，有26个患者由于心血管 事件(cardiovasculary event)而在24个月中死亡。为了评估两个标志的预后功效，使 用Cox-回归(用于windows的StatView 5. 0软件；Abacus Conc印ts， Berkley, CA)分析 数据。NT-proBNP的值(以pg/ml表示)的中值是氨基末端proANP(以pmol/1表示)的5 倍。因此，在Cox-分析中，与MR-proANP相比，所计算的NT-proBNP风险比率，浓度提高至 5倍。 单变量Cox比例风险分析(皿ivariant Cox Proportional HazardAnalysis)的 结果 MarkerChiSquare 风险比率(95% CI) pNT proANP(100pmo1/1提高)14. 414 1. 503 (1. 217-1. 855)< 0. 0001NT-proBNP (500pg/ml提高) 0. 662 1. 024 (0. 963-1. 094) 0. 416 不依赖于对于NT-proBNP(p = 0. 416)未获得显著的结果的事实，与
NT-proBNP (1. 024)相比，NT-proANP的1. 503的风险比率清楚地显示在BMI > = 30的患
者亚群中的优点。1.000的风险比率表示每浓度单位剂量的死亡风险不增加。因而，对
于NT-pro ANP， 1. 503的风险比率表示每浓度单位(此处lOOpmol/I)的死亡风险提高了
50. 3%。与NT-proBNP相比，这表示该风险提高了 21倍。 多变量Cox比例风险分析的结果 MarkerChi Square 风险比率(95% CI) pLN NT-proANP 7. 198 2. 776 (1. 317-5. 854) 0.007
LN NT-proBNP 0. 005 0. 985 (0. 644-1. 506) 0.943 再次地，结果证明了 NT-proANP的优点，因为其在使用NT-proBNP (p = 0. 007)的 模型中继续作为BMI >= 30的患者亚群中的死亡的独立预测指标(predictor)。与之相 反，NT-proBNP不是独立的预测指标。 同样在ROC分析中，就BMI > = 30的患者亚群的死亡率预后而言，NT-proANP (AUC 为0. 66)优于NT-proBNP (AUC = 0. 61)。关于预后，NT-proANP的最佳阈值是199pmol/l。
实施例2
研究群体 我们前置地连续招募在ED出现的患者。为了有资格参与研究，患者必须具有呼吸 困难作为最显著的症状。不包括18岁以下的患者、进行血液透析的患者和创伤患者。研究 按照赫尔辛基宣言的原则进行并且由地方伦理委员会批准。从所有参加患者获得书面试服 志愿书。 患、剖勺驢i平fe 患者经历临床评估，包括临床史、体检、ECG、脉搏血氧测定法(pulseoximetry)、血 液检测包括动脉血气分析(当指出时)和胸部X射线检查。如果患者得到允许，基于门诊 病人基数在ED或在医院强烈推荐超声心动图和肺功能测验。对于每一个参加本研究的患 者，ED医生估计患者具有HF(通过赋予0至100%的临床确定性值)作为他或她的呼吸困 难的原因(包括体检、EGG、胸部X射线检查和血检验(包括BNP)的所有可获得的信息)的 概率。 心力衰竭的参照("金")指示定义 为了确定实际的诊断，两个独立的心脏病学家研究了与患者相关的所有医疗记 录并且独立地将诊断分类为HF引起的呼吸困难或除了 HF外的另外的原因引起的呼吸困 难。两位心脏病学家都有权使用在于ED中进行评估期间或之后成为可获得的ED图(ED charts)和任何额外的信息。该信息包括BNP水平、胸部X射线检查、对于ED医生是不 可获得的医疗史、后续检测例如超声心动图、放射性核素成像或在心导管检查(cardiac catheterization)时进行的左心室造影图(leftventriculogr即hy)、肺功能测验、CT扫 描、用于评估肺栓塞的压迫超声(compression ultrasound)、右心导管插入术的结果、被送 入医院的患者的住院治疗情况(hospital course)、对治疗的反应、已故患者的尸检数据以 及关于临床活动或在90天的随访过程中再住院的信息。BNP水平被当作HF的定量标志，从 而被解释为充分利用由该试验提供的信息的连续变量。BNP水平越高，则HF出现和其为呼 吸困难的原因的概率越高。对于肾病和肥胖症的存在，调整绝对BNP值以使诊断的准确性 最大化(Mueller, C.等人，Swiss Med Wkly，2007. 137(1-2) :p. 4-12.)。
利钠肽的测暈 在最初的评估期间，将血液样品收集入含有乙二胺四乙酸钾的试管。分析来自 立即于-80°C下冷冻直至分析的血桨样品的MR-proANP和NT-proBNP。使用在其他地方 (Morgenthaler， N. G.，等人，CKn Chem， 2004. 50 (1) :p. 234-6.)详细描述的夹心免疫测定 法(MR-proANP LIA， B. R. A. H. M. S， He皿igsdorf/Berlin， Germany)进行MR-proANP的检 测。之前的研究中325个健康个体的MR-proANP中值是45pmol/l (95%的置信区间(CI)43 至49pmol/l) (Morgenthaler, N. G.，等人，Clin Chem， 2004. 50 (1) :p， 234—6.)。通过定量
11电fti学发光免疫领lj定f去(Elecsys proBNP， Roche Diagnostics AG， Zug， Switzerland)领lj 定NT-proBNP水平。通过微粒酶免疫测定法(AxSym， Abbott Laboratories, IL， USA)测量 BNP。 统计分析 使用非参数曼-惠特尼U检验或适当时费希尔精确检验(Fisher' sexact test) 来比较患有HF引起的呼吸困难的患者和患有非HF引起的呼吸困难的患者之间的关于人口 统计学和临床特征的单变量数据。MR-proANP和NT-proBNP被认为是连续变量并且对其进 行对数变换以获得正态性(normality)。主要目的是将MR-proANP的准确度与NT-proBNP的 准确度相比较。当BNP水平可获得用于HF的参照("金")标准诊断时，MR-proANP与BNP 的比较被认为偏向BNP，从而在ROC分析中不包括BNP。第二目的是调查向ED的临床判断 中加入MR-proANP，包括胸部X射线检查和BNP信息，是否可进一步提高诊断准确度。为了 确定MR-proANP和NT-proBNP对于HF的诊断准确度，分析受试者工作特征(ROC)曲线，并 且对于两个标志计算曲线下的面积(AUC)。按照由Hanley和McNeil (Hanley， J. A.等人， Radiology, 1983. 148(3) :p. 839-43.)提出的方法比较AUC。通过在ROC曲线上选择使灵敏 度和特异性最大化的点来获得最佳截止点(cut-off-point)。选择对于HF的ED临床确定性 > 80%的最佳截止点，提供合理且可操作的(actionable)确定性的截止点，McCullough， P. A.，等人，Circulation, 2002. 106(4) :p. 416_22。利用McNemar检验(假生物化学分类 的不和谐配对的比较)比较两个测定法在使用ROC分析测定的最佳截止浓度上的诊断准确 度。对于HF的检测，为了测定关于最高诊断准确度的MR-proANP和NT-proBNP的阈值的 优势比，在未调节和已调节的情况下进行logistic因归分析以获得显著的协变量(年龄、 先前的CHF、先前的心肌梗塞、估计的肾小球滤过率、血红蛋白、肺啰音(pulmonary rale)、 外周性水肿和颈静脉扩张)。等级相关的斯皮尔曼系数用于估计研究群体中MR-proANP和 NT-proBNP浓度的关系。使用以千克表示的体重除以以米表示的身高的平方的习用式来计 算体重指数(BMI)。按照世界卫生组织的定义，正常重量定义为BMI < 25kg/tf，超重定义 为25kg/m2至29. 9kg/m2的BMI，肥胖定义为30kg/m2或更大的BMI。使用肾脏疾病饮食改 变(Modification of Diet in RenalDisease) (MDRD)公式(Stevens, L. A.等人，N Engl J Med， 2006. 354(23) :p. 2473-83.)来计算肾小球滤过率。使用SPSS 15. 0软件(SPSS Inc， Chicago, Illinois, USA)和MedCalc 9. 3. 9. 0软件包(MedCalc Software, Mariakerke， Belgium)统计分析数据。对所有概率进行双尾检验，p < 0. 05被认为是显著的。
题 总共287个患者参与本研究(图3)。年龄中值为77岁。有149个男性(52% ) 和138个女性(48%)。动脉高血压存在于68%的患者中，28%具有冠心病，以及34%具有 慢性阻塞性肺疾患。利尿剂(52%)是最常的处方慢性药疗法(chronic medication)，接 着是ACE-抑制剂或AT-II-受体-阻滞剂(49%)和P-阻滞齐[J (39%)。当检查时，54% 的患者在下肺野具有啰音，42%具有下肢浮肿以28%具有颈静脉扩张。
判断的金标准诊断为在154个(54% )患者中具有HF，71个(25% )患者中具有 慢性阻塞性肺疾患，33个(11%)患者中具有肺炎，10个(3%)患者中具有恶性肿瘤，8个 (3%)患者中具有肺栓塞，7个(2%)患者中具有换气过度以及在14个(5%)患者中具有 其他病因例如间质性肺病、哮喘或支气管炎。有几个患者具有两个呼吸困难的主要病因例
12如慢性阻塞性肺疾患和肺炎的恶化。 患有和不患有判断的HF的金标准诊断的患者的MR-proANP和NT-proBNP水平示 于图4中。患有HF的此类患者的MR-proANP中值浓度(400pmol/L， IQR 246_642pmol/l)显 著高于不患有HF的患者的MR-proANP中值浓度(92pmol/L， IQR 92_173pmol/l ;p< 0.001， 对于差异)。患有HF的患者的NT-proBNP中值浓度为5757pg/ml (IQR 1924_13243pg/ml) 对不患有HF的患者的300pg/ml (IQR 76_974pg/ml) (p < 0. 001，对于差异)。MR-proANP与 NT-proBNP之间的等级相关的斯皮尔曼系数为0. 899 (p < 0. 001)。 对于HF的诊断，MR-proANP的AUC为0. 92 (95 % CI 0. 88至0. 95)，这与具有 0. 92 (95% CI 0. 89至0. 95 ;p = 0. 791 ;图6a)的NT-proBNP的AUC —致。基于ROC分析的
基础，达到最高诊断准确度的MR-proANP和NT-proBNP的最佳诊断截止值分别为206pmol/l 和1540pg/ml。在该截止值上，MR-proANP的准确度、灵敏度和特异性全都为84% 。 Logistic 回归分析确认MR-proANP在单变量和多变量分析中为HF的高效预测指标(图5)。
ED-概率与MR-proANP的组合的AUC显著比单独的ED-概率高(p = 0. 016，图6b)。 具有HF的高ED概率(80%至100%临床确定性)的临床判断的准确度为79.4%。因此，作 为诊断值的总体测量，向ED-概率中加入> 206pmol/L的MR-proANP水平将显著地将诊断 准确度增加至87. 8% (p < 0. 001，图7)。总的来说，206pmol/L的截止值处的MR-proANP和 > 80%确定性的ED-概率是相对独立的指标，如通过0. 47的CohensK即pa值所反映的(p < 0. 001)。 如图8中所示，在它们与BMI结合方面，MR-proANP和NT-proBNP不同。在患有HF 的患者中，与具有正常BMI的个体相比，平均MR-proANP水平在超重和肥胖患者中是不同的 (对于二者，P = 0. 346)，其中NT-proBNP水平在超重和肥胖患者中比在正常体重患者中低 (对于二者，P = 0. 025)。
附图概述
图1 :显示NT-pro ANP的序列。 图2 :显示proANP的序列。举例说明287个患者的基线特征的表。 图3 :举例说明287个患者的基线特征的表；eGRF =估计的肾小球滤过率；
MR-proANP =中间区域前心房利钠肽；NT-proBNP = N_末端B型利钠肽前肽。 图4 :显示患有心力衰竭引起的呼吸困难的患者(n = 154)和患有归因于其他原
因的呼吸困难的患者(n = 133)的NT-proBNP和MR-proANP的水平的框图(box plot);所
有p < 0. 001。NT-proBNP = N_末端B型利钠肽前肽；MR-proANP =中间区域前心房利钠肽。
框(box)代表第百分之25和第百分之75，其中细线(whisker)代表最小至最大浓 度，不包括展示为分离点的离群值。 图5 :说明用于通过MR-proANP和NT-proBNP预测心力衰竭的logistic回归分析 的表；MR-proANP =中间区域前心房利钠肽；NT-proBNP = N-末端B型利钠肽前肽。说明用 于通过MR-proANP和NT-proBNP预测心力衰竭的logistic回归分析的表。
图6a :NT-proBNP和MR-proANP用于诊断患有呼吸困难的患者的心力衰竭的准 确度的受试者工作特征(ROC)曲线。曲线下的面积(AUC):对于NT-proBNP = 0.92 ;对于 MR-proANP = 0. 92 (对于比较，p = 0. 791)。
图6b :急诊科(ED)-概率、MR-proANP和两者在心力衰竭的检测中的受试者工作特 征(ROC)曲线。(曲线下的面积(AUC):对于MR-proANP = 0. 92 ;对于ED-概率=0. 90 ;对 于组合=0. 96 ;p = 0. 016，对于ED-概率与ED-概率和MR-proANP的组合的比较)。 [cms] 图7 :临床判断(心力衰竭的高急诊科概率)、使用206pmol/L的截止水平的 MR-proANP以及两者组合在心力衰竭的检测中的诊断准确度(p < 0. 001)。
图8:根据体重指数(BMI)分类的患有和不患有心力衰竭的患者中的平均 NT-proBNP和MR-proANP水平。
权利要求
用于患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的医学诊断、预后和治疗随访的体外方法，该方法包括步骤-提供患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的样品，-使用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体测定所述样品中的氨基末端proANP或其具有12至98个氨基酸的部分肽，-将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水平归因于临床现象，其中所述归因是不依赖患者的BMI进行的。
2. 权利要求l的体外方法，其中，所述将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水 平归因于临床现象是借助于不依赖于BMI的截止值进行的。
3. 权利要求1或2的体外方法，其中所述心脏病选自包含慢性心力衰竭、急性心力衰 竭、急性冠状动脉综合征和心肌梗塞的组。
4. 权利要求1至3的体外方法，其中所述方法是用于医学诊断的方法。
5. 权利要求1至4的体外方法，其中患者展示呼吸困难的症状，从而被怀疑具有心力衰竭。
6. 权利要求1至5的体外方法，其中患者或患者群体具有等于或大于30kg/m2的BMI， 并且样品是由具有具有等于或大于30kg/m2的BMI的患者提供的。
7. 权利要求6的体外方法，其中所述方法是预后的方法。
8. 权利要求6或7的体外方法，其中所述疾病是慢性心力衰竭。
9. 权利要求1至8的体外方法，其中所述提供的患者的样品选自包含血浆、血清、血液 和尿的组。
10. 权利要求1至9的体外方法，其中将结合其他标志和/或方法进行所述方法。
11. 权利要求1至10的体外方法，其中在患者样品中测定至少一种其他标志，所述标志 选自包含炎症标志、心血管标志和局部缺血标志的组。
12. 权利要求ll的体外方法，其中所述炎症标志选自包含下列的组C-反应性蛋白 (CRP)、细胞因子例如TNF-a 、白细胞介素例如IL-6、原降钙素1-116或其具有从12至116 个氨基酸优选具有100至116个氨基酸的肽，和粘附分子例如VCAM或ICAM。
13. 权利要求11的体外方法，其中所述心血管标志选自包含下列的组髓过氧化物酶、 完整的proBNP或proBNP的长度为至少12个氨基酸残基的肽片段包括BNP和NT-proBNP、前 内皮素-l、肾上腺髓质素前体、血管加压素前体、胃泌素释放肽前体(proGRP)、瘦素前体、 神经肽Y原、生长抑素原、神经肽Y Y原、前阿黑皮素。
14. 权利要求11的体外方法，其中所述局部缺血标志选自包含肌钙蛋白I或T、CK-MB、 肌红蛋白的组。
15. 权利要求1至14的体外方法，其中以快速检验测定的方式进行所述方法。
全文摘要
本发明涉及用于患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的医学诊断、预后和治疗随访的体外方法，其包括步骤提供患有心脏病或被怀疑发生或患有心脏病的患者的样品，使用至少一种特异性结合氨基末端proANP的部分序列的抗体测定所述样品中的氨基末端proANP或其具有12至98个氨基酸的部分肽，将测定的氨基末端proANP水平或其部分肽的水平归因于临床现象，其中所述归因是不依赖患者的BMI进行的。本发明还涉及快速检验测定法和用于进行本发明方法的试剂盒以及适合于根据本发明的方法和测定法的抗体的用途。
文档编号G01N33/74GK101784899SQ200880015355
公开日2010年7月21日 申请日期2008年5月6日 优先权日2007年5月7日
发明者A·伯格曼, J·帕帕索蒂里奥, J·斯特鲁克, N·摩根萨勒, S·安克 申请人:B.R.A.H.M.S股份公司