专利名称：心脏病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的心肌梗塞治疗剂及其 应用。另外，本发明还涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的心肌梗塞 后左心室重塑的抑制剂及其应用。
背景技术：
心肌梗塞是缺血性心脏病的一种，是由于动脉硬化等引起心脏冠 状动脉收缩，冠状动脉血流量急剧减少或停止而引起心肌坏死的一种 疾病。如果梗塞区域扩大、恶化，则会并发心力衰竭、缺血等引起的 重度心律不齐，而增加对生命的威胁。若心肌梗塞进行，则梗塞区的心肌细胞坏死、脱落，被胶原纤维 等纤维组织替换。这种梗塞区缺乏收缩力，不能耐受伴随心收缩而上 升的心内压，纤维壁薄且伸展。其结果，为了弥补这种功能降低，在 非梗塞区导致心内腔肥大，左心室整体扩张。这种现象被称为左心室 重塑，使心脏功能进一步降低，之后的患病率和死亡率增加。因此为 了预后改善心肌梗塞症，尽早抑制进行中的左心室重塑是很重要的， 期望构筑一种有效的治疗方法。IL-6是一种细胞因子，也被称为B细胞刺激因子2 (BSF2)或干 扰素(32。IL-6是作为与B淋巴细胞的活化有关的分化因子被发现的(非 专利文献l)，之后发现是一种影响各种细胞功能的多功能细胞因子(非 专利文献2)。据报道IL-6可以诱导T淋巴细胞的成熟(非专利文献 3) IL-6在细胞上通过两种蛋白质传导其生物学活性。 一种是IL-6结 合的分子量约80kD的配体结合性蛋白质的IL-6受体(非专利文献4、 5) 。 IL-6受体，除了贯通细胞膜在细胞膜上表达的膜结合型之外，主 要是作为由其细胞外区域构成的可溶性IL-6受体而存在。另一种是与非配体结合性的信号转导相关的分子量约130kD的膜 蛋白质gpl30。 IL-6与IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合体，然后通过 与gpl30结合，IL-6的生物学活性被传导到细胞内(非专利文献6)。IL-6抑制剂是抑制IL-6的生物学活性传导的物质。迄今为止，已 知有对抗IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、对抗IL-6受体的抗体(抗IL-6 受体抗体)、对抗gpl30的抗体(抗gpl30抗体)、IL-6变体、IL-6 或IL-6受体部分肽等。关于抗IL-6受体抗体，也有一些报道(非专利文献7、 8，专利文 献1~3)。其中之一已知有人源化PM-1抗体(专利文献4)，其是通过 将小鼠抗体PM-1 (非专利文献9)的互补决定区(CDR; complementarity determining region)寿多植入人抗体而"f寻至!j的。迄今为止，从IL-6对肌收缩性功能产生负面影响(非专利文献IO)， 或者IL-6和IL-6受体的过剩表达而使gpl30活性恒定的小鼠发生心脏 肥大(非专利文献ll)等，可知其会影响心脏的功能和构造。IL-6在 心肌梗塞后，在左心室、特别是再灌流的心肌梗塞的边界部分表达(非 专利文献12),其表达水平与心肌梗塞后的左心室(LV)的大小有关 (非专利文献13)。另外，据报道在低氧压下心肌细胞产生IL-6 (非 专利文献14),梗塞后重塑时，非肌肉细胞中的细胞因子表达在胞外 基质变化中有控制作用(非专利文献15)。此外，关于心肌梗塞与IL-6 的关系，有报道称通过IL-6介导而被活化的JAK/STAT系对心肌梗塞 有保护作用(非专利文献16)。另一方面，有报道称，在使用IL-6敲除小鼠的实验中，IL-6缺失 对心肌梗塞的梗塞区域的大小或左心室重塑等没有影响(非专利文献 17)。由此，心肌梗塞以及心肌梗塞后左心室重塑中的IL-6的作用并不清楚。此外，本申请的发明相关的背景技术文献信息如下所示。非专利文献1: Hirano, T. et al" Nature (1986) 324， 73-76非专利文献2: Akira， S. et al" Adv. in Immunology (1993) 54,1-78非专利文献3: Lotz， M. et al" J. Exp. Med. (1988)167， 1253-1258非专利文献4: Taga， T. et al" J. Exp. Med. (1987) 166， 967-981非专利文献5: Yamasaki， K. et al" Science (1988) 241， 825-828非专利文献6: Taga， T. et al" Cell (1989) 58， 573-581非专利文献7: Novick， D. et al" Hybridoma (1991) 10， 137-146非专利文献8: Huang, Y. W. et al" Hybridoma (1993) 12， 621-630非专利文献9: Hirata， Y. et al" J. Immunol. (1989) 143， 2900-2906非专利文献10: Finkel， M. S. et al.， Science (1992) 257， 387-389 非专利文献11: Hirota， H. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92， 4862-4866非专利文献12: Gwechenberger， M. et al.， Circulation (1999) 99， 546-551非专利文献13: Ono， K. et al.， Circulation (1998) 98， 149-156 非专利文献14: Yamauchi-Takihara， K. et al.， Circulation (1995) 91 1520-1524非专利文献15: Yue， P. et al" Am.丄Physiol. (1998) 275，H250-H258 非专利文献16: Negoro， S. et al.， Cardiovasc. Res. (2000) 47， 797-805非专利文献17: Fuchs M. et al.， FASEB J. (2003) 17， 2118-2120 专利文献l:国际专利申请公开号WO 95-09873 专利文献2:法国专利申请/^开号FR2694767 专利文献3:美国专利号US 5216128 专利文献4:国际专利申请公开号WO 92-19759发明内容迄今为止，虽然表明IL-6与心肌梗塞以及心肌梗塞后的左心室重 塑有关，但其详细的作用并不明确。另外，IL-6抑制剂的给药，在心 肌梗塞以及心肌梗塞后的左心室重塑中有怎样的效果也不明确。本发明即是鉴于这种情况完成的，其目的在于提供含有IL-6抑制 剂作为有效成分的心肌梗塞治疗剂。另外，本发明还提供含有IL-6抑 制剂作为有效成分的心肌梗塞后的左心室重塑的抑制剂。而且本发明 还提供治疗心肌梗塞的方法以及抑制心肌梗塞后左心室重塑的方法， 所述方法包括将IL-6抑制剂给予有心肌梗塞症状的对象的工序。本发明人为了解决上述技术问题，对于抗IL-6受体抗体改善心肌 梗塞中梗塞区域的状态的效果，以及抑制心肌梗塞后左心室重塑的效 果进行了研究，首先，本发明人将雄性Balb/c小鼠的左前降支结扎，制成心肌梗 塞模型小鼠。然后，对该心肌梗塞模型小鼠腹腔内给予抗IL-6受体抗 体(MR16-1 ) 500ng。其结果表明，在心肌梗塞区域，髓过氧化物酶(MPO)活性的增加 被显著抑制。另外，还表明在抗IL-6受体抗体给药小鼠中，心肌MCP-1 (单核细月包趋寸匕蛋白-l, monocyte chemoattractant protein陽l)的表达在心 肌梗塞区域以及非梗塞区域被抑制。而且，在心脏超声波检查、组织 学检查中，抗IL-6受体抗体给药小鼠的心脏肥大被抑制。即，本发明人通过给予抗IL-6受体抗体，初步发现可以改善心肌 梗塞中梗塞区域的状态，抑制心肌梗塞后的左心室重塑，由此完成了 本发明。更具体地，本发明提供以下的[1] [311。11含有IL-6抑制剂作为有效成分的心肌梗塞治疗剂。 [2根据[1所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 的抗体。[31根据[11所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 受体的抗体。[4J根据[2]或[3所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗体是单克隆抗 体。5根据21或31所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗体是抗人IL-6 的抗体或者抗人IL-6受体的抗体。[6根据2或[3所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗体是重组抗体。 [7根据[6所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人 源化抗体或人抗体。[8含有IL-6抑制剂作为有效成分的心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂。 [9根据[81所述的抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6的抗 体。卩0根据8所述的抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6受体 的抗体。111根据[9或[101所述的抑制剂，其特征在于，抗体是单克隆抗体。12根据[9或[10所述的抑制剂，其特征在于，抗体是抗人IL-6的抗体 或者抗人1L-6受体的抗体。[13根据[9或[10所述的抑制剂，其特征在于，抗体是重组抗体。 [141根据[131所述的抑制剂，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗 体或人抗151根据[8卜14任一项所述的抑制剂，其用于心肌梗塞的治疗。 [16I对对象治疗心肌梗塞的方法，其包含将IL-6抑制剂给予有心肌梗 塞症状的对象的工序。17]对对象抑制心肌梗塞后左心室重塑的方法，其包含将IL-6抑制剂 给予有心肌梗塞症状的对象的工序。[181根据16或17所述的方法，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 的抗体。[19根据16或17所述的方法，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 受体的抗体。[20根据18或[19所述的方法，其特征在于，抗体是单克隆抗体。 [21根据181或191所述的方法，其特征在于，抗体是抗人IL-6的抗体 或者抗人IL-6受体的抗体。22根据181或[191所述的方法，其特征在于，抗体是重组抗体。23根据221所述的方法，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。24IL-6抑制剂在制造心肌梗塞治疗剂中的用途。[251IL-6抑制剂在制造心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂中的用途。[26〗根据24或[25〗所述的用途，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 .的抗体。27根据24或[25所述的用途，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6 受体的抗体。281根据[26或[271所述的用途，其特征在于，抗体是单克隆抗体。29根据[26或[27所述的用途，其特征在于，抗体是抗人IL-6的抗体 或者抗人IL-6受体的抗体。301根据[26或[27I所述的用途，其特征在于，抗体是重组抗体。 [31根据130所述的用途，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。
具体实施方式
本发明人发现通过给予抗IL-6受体抗体，可以改善心肌梗塞中 梗塞区域的状态，抑制心肌梗塞后的左心室重塑。本发明即是基于上 述发现的发明。本发明涉及心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂，它们含有IL-6抑制剂作为有效成分。本发明中，"IL-6抑制剂"是指阻断IL-6介导的信号转导、抑制IL-6 的生物学活性的物质。IL-6抑制剂优选为对IL-6、 IL-6受体和gpl30 的任一结合具有抑制作用的物质。作为本发明的IL-6抑制剂，例如可列举抗IL-6抗体、抗IL-6 受体抗体、抗gpl30抗体、IL-6变体、可溶性IL-6受体变体或者IL-6 或IL-6受体的部分肽，以及与它们显示同样活性的低分子物质，但并 无特别地限定。作为本发明的IL-6抑制剂，可优选列举识别IL-6受体 的抗体。本发明中抗体的来源没有特别限定，可优选列举来源于哺乳动物 的抗体，更优选列举来源于人的抗体。本发明中使用的抗IL-6抗体，可以使用公知的方法作为多克隆或 单克隆抗体而得到。作为本发明中使用的抗IL-6抗体，特别优选来源 于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体有，杂 交瘤中产生的抗体，以及通过基因工程方法，在以含有抗体基因的表 达载体转化的宿主中产生的抗体。该抗体通过与IL-6结合，从而抑制 IL-6与IL-6受体的结合，进而阻断IL-6的生物学活性向细胞内传达。作为这种抗体，可以列举出MH166 (Matsuda， T. ^ "/ ， Eur. J. Immunol. (1988) 18， 951-956)或SK2抗体(Sato, K. W fl/.，第21次日本 免疫学会总会，学术纪录(1991)21，166)等。产生抗IL-6抗体的杂交瘤，基本上可以使用公知技术，按如下所 述进行制作。即，使用IL-6作为致敏性抗原(感作抗原)，将其按照 通常的免疫方法进行免疫，根据通常的细胞融合法使所得免疫细胞与 公知的亲细胞(parent cells )融合，使用通常的筛选法，筛选产生单克 隆抗体的细胞，而进行制作。具体地，可以按照如下所述制作抗IL-6抗体，例如，作为获得抗 体的致敏性抗原使用的人IL-6，可以通过使用Eur. J. Biochem. (1987) 168， 543-550; J. Immunol. (1988) 140， 1534-1541或Agr. Biol. Chem. (1990) 54， 2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列而得到。将IL-6的基因序列插入公知的表达载体系，使适当的宿主细胞进 行转化后，用公知的方法从其宿主细胞中或培养上清液中纯化(精製)目标IL-6蛋白质，可以使用该纯化IL-6蛋白质作为致敏性抗原。另夕卜， 也可以使用IL-6蛋白质与其它的蛋白质的融合蛋白质作为致敏性抗 原。本发明中使用的抗IL-6受体抗体，可以使用公知的方法作为多克 隆或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗IL-6受体抗体，特别优 选来源于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体 有，杂交瘤中产生的抗体，以及通过基因工程方法，在以含有抗体基 因的表达载体转化的宿主中产生的抗体。该抗体通过与IL-6受体结合， 而抑制IL-6与IL-6受体结合，进而阻断IL-6的生物学活性向细胞内 的传达。作为这种抗体，可列举MR16-1抗体(Tamura， T. fl/" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90， 11924-11928)、 PM醫1抗体(Hirata， Y. W a/.， J. Immunol. (1989) 143， 2900-2906)、 AUK12-20抗体、AUK64画7抗 体或AUK146-15抗体(国际专利申情公开号W0 92-19759)等。其中， 作为抗人IL-6受体优选的单克隆抗体，可示例PM-1抗体；另外作为 抗小鼠IL-6受体优选的单克隆抗体，可列举MR16-1抗体。产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤，基本上可以使用公知技术， 按如下所述进行制作。即，使用IL-6受体作为致敏性抗原，将其按照 通常的免疫方法进行免疫，根据通常的细胞融合法使所得免疫细胞与 公知的亲细胞融合，使用通常的筛选法，筛选产生单克隆抗体的细胞， 而进行制作。具体而言，可以按照如下所述制作抗IL-6受体抗体。例如，作为 获得抗体的致敏性抗原使用的人IL-6受体、小鼠IL-6受体可以如下述 那样得到人IL-6受体可以使用欧洲专利申请公开号EP325474中公 开的IL-6受体基因/氨基酸序列而得到；小鼠IL-6受体可以使用日本 专利申请公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列 而得到。IL-6受体蛋白质有在细胞膜上表达的和脱离细胞膜的(可溶性 IL-6受体)(Yasukawa， K. C fl/" J， Biochem. (19卯)108， 673國676)两种。 可溶性IL-6受体实质上由结合在细胞膜上的IL-6受体的细胞外区域构 成，在缺失跨细胞膜区域或缺失跨细胞膜区域和细胞内区域方面，与 膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白质，只要能用作本发明中所用的制作抗IL-6受体抗体的致敏性抗原，则可以使用任一种IL-6受体。 将IL-6受体的基因序列插入公知的表达载体系，使适当的宿主细 胞转化后，用公知的方法从其宿主细胞中或培养上清液中精制目的物 IL-6受体蛋白质，可以使用该纯化IL-6受体蛋白质作为致敏性抗原。 另外，也可以使用表达IL-6受体的细胞或者IL-6受体蛋白质与其它蛋 白质的融合蛋白质作为致敏性抗原。本发明中使用的抗gpl30抗体，可以使用公知的方法作为多克隆 或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗gpl30抗体，特别优选来 源于哺乳动物的单克隆抗体。作为来源于哺乳动物的单克隆抗体有， 杂交瘤中产生的抗体，以及通过基因工程方法，在以含有抗体基因的 表达栽体转化的宿主中产生的抗体。该抗体通过与gpl30结合，而抑 制IL-6/IL-6受体复合体与gpl30的结合，进而阻断IL-6的生物学活性 向细胞内的传达。作为这种抗体，可列举AM64抗体(日本特开平3-219894)、 4B11 抗体以及2H4抗体(US 5571513)B-S12抗体和B-P8抗体(日本特开平 8-291199)等。产生抗gpl30单克隆抗体的杂交瘤，基本上可以使用公知技术， 按如下所述进行制作。即，使用gpl30作为致敏性抗原，将其按照通 常的免疫方法进行免疫，根据通常的细胞融合法使所得免疫细胞与公 知的亲细胞融合，使用通常的筛选法，筛选产生单克隆抗体的细胞， 而进行制作。具体而言，可以按照如下所述制作单克隆抗体，例如，作为获得 抗体的致敏性抗原所使用的gpl30,可以通过使用欧洲专利申请公开号 EP411946公开的gpl30基因/氨基酸序列而得到。将gpl30的基因序列插入公知的表达载体系，使适当的宿主细胞 转化后，用公知的方法从其宿主细胞中或培养上清液中精制目的物 gpl30蛋白质，可以使用该纯化gpl30蛋白质作为致敏性抗原。另夕卜， 也可以使用表达gpl30的细胞或者gpl30蛋白质与其它蛋白质的融合 蛋白质作为致敏性抗原。作为用致敏性抗原来免疫的哺乳动物，没有特别地限定，但优选 考虑与细胞融合中所使用的亲细胞的适合性后进行选择， 一般使用啮 齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。用致敏性抗原对动物免疫，根据公知的方法进行。例如，作为一 般的方法，通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏性抗原而进行。具体而言，优选将致敏性抗原用PBS (磷酸緩沖盐)或生理盐水等稀 释至适当量，根据需要，将悬浊的液体与通常的佐剂，例如弗氏完全 佐剂适量混和，乳化后，每4-21天对哺乳动物多次给药。另外，致敏 性抗原免疫时可以使用适当的载体。如此进行免疫，确认血清中所需的抗体水平上升后，从哺乳动物 中取出免疫细胞，进行细胞融合。作为用于细胞融合的优选的免疫细 胞，特别列举脾细胞。作为与前述免疫细胞融合的其他的亲细胞即哺乳动物的骨髓瘤细 胞，可适当使用已经公知的细胞林，例如P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. W / ， J. Immunol (1979) 123， 1548-1550)、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, l誦7)、 NS-1 (Kohler，G. and Milstein， C.， Eur. J. Immunol. (1976) 6,511-519)、 MPC-11 (Margulies， D. H. & a/.， Cell (1976) 8， 405-415)、 SP2/0 (Shulman， M. W "/" Nature(1978)276， 269-270)、 FO (de St. Groth， S. F. W fl/" J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21)、 S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323)、 R210 (Galfre， G. " fl/.， Nature (1979) 277， 131-133)等。前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以基于公知的方 法，例如Milstein等的方法(Kohler， G. and Milstein, C.， Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46)等而进行。更具体地，前述细胞融合例如可以在细胞融合促进剂的存在下在 通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需要为了提高融合效率， 也可以添加使用二曱基亚砜等辅助剂。免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，例如相对于骨髓瘤细胞，优 选免疫细胞为1 10倍。作为前述细胞融合中使用的培养液，例如可以 使用适于前述骨髓瘤细胞林增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、 其他在该种细胞培养中使用的通常的培养液，而且也可以并用胎牛血 清(FCS)等血清补充液。细胞融合是，在前述培养液中将规定量的前述免疫细胞和骨髓瘤 细胞充分混合，通常以30~60 % (w/v)的浓度添加预先加热至37。C左右的PEG溶液，例如平均分子量1000-6000左右的PEG溶液，进行混合， 从而形成目的物融合细胞(杂交瘤)。然后逐次添加适当的培养液， 通过重复离心除去上清液的操作，从而可以除去不利于杂交瘤生长的 细胞融合剂等。该杂交瘤通过在通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄 嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养液)中培养而进行选择。为了 使目的物杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，在该HAT培养液中 的培养，需要持续充分的时间，通常持续数天 数周。然后，实施通常 的极限稀释法，进行产生目的物抗体的杂交瘤的筛选以及克隆。另外，除了对人以外的动物免疫抗原，得到上述杂交瘤以外，也 可以在体外(in vitro)将人淋巴细胞用所需的抗原蛋白质或抗原表达 细胞致敏，使致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞(例如U266)融合，可 以得到与所需的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所需的人抗体 (参照日本特公平1-59878 )。另外，对具有人抗体基因的所有组成成 分(1/"一卜y )的转基因动物给予抗原或抗原表达细胞，根据前述 的方法也可以获得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号 W093/12227, WO 92/03918， WO 94/02602， WO 94/25585， WO 96/34096 WO 96/33735)。这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中进行 继代培养，另外可以在液氮中长期保存。从该杂交瘤获得单克隆抗体时，可以采用以下方法将该杂交瘤 按照通常的方法进行培养，作为其培养上清液而获得的方法；或者将 杂交瘤给予与它具有适合性的哺乳动物并使增殖，作为其腹水而得到 的方法等。前者的方法适于得到高纯度的抗体，另一方面，后者的方 法适于抗体的大量生产。例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制作，可以根据日本特开 平3-139293中ziS开的方法进行。可以用以下方法进行将产生PM-1 抗体的杂交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔内得到腹水，从该腹水中精制 PM-1抗体的方法；或者将本杂交瘤在适当的培养基，例如含有10%胎 牛血清、5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim制)的RPMI 1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基 (GIBCO-BRL制)等中培养，从其培养上清液中精制PM-1抗体的方法。本发明中，作为单克隆抗体，可以使用以下重组抗体从杂交瘤 中克隆抗体基因，插入适当的载体，将其导入宿主，使用基因重组技 术而产生的重组抗体(例如参照Borrebaeck， C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990 )。具体而言，从产生目标抗体的细胞(例如杂交瘤)中分离编码抗 体的可变(V)区的mRNA。 mRNA的分离，通过公知的方法，例如 胍超速离心法(Chirgwin, J. M. " Biochemistry (1979) 18， 5294-5299) 、 AGPC法(Chomczynski， P. W fl/.， Anal. Biochem. (1987) 162， 156-159)等制备总RNA，使用mRNA Purification Kit (Pharmacia 制)等制备mRNA。另外通过使用QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia制)可以直接制备mRNA。使用逆转录酶由得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。 cDNA的 合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等进4亍。另夕卜，进4亍 cDNA的合成和扩增时，可以使用5，-RACE法(Frohman， M. A. C Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. & "/ ， Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932)，所述5,-RACE法使用 5，國Ampli FINDER RACE Kit (Clontech制)和PCR。从得到的PCR产 物中纯化目标DNA片段，与栽体DNA连接。进而由此制成重组栽体， 导入大肠杆菌等并选择菌落，来制备所需的重组载体。通过公知的方 法(例如脱氧法)来确认目标DNA的碱基序列。如果得到作为目的物的编码抗体V区的DNA，则将其与编码所需 的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其插入表达载体。或者也可以 将编码抗体V区的DNA插入含有抗体C区的DNA的表达栽体。制造本发明中使用的抗体时，如后所述将抗体基因插入表达载体， 以使其在表达控制区，例如增强子、启动子的控制下表达。然后，通 过该表达载体可以转化宿主细JJ包、使抗体表达。在本发明中，以降低对人的异种抗原性等作为目标，可以使用人 为修饰(改変)的基因重组抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源 化(Humanized)抗体、人(Human)抗体。这些修饰的抗体可以使 用已知的方法进行制造。嵌合抗体可通过下述方式得到将编码如前述那样得到的抗体V 区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其插入表达载体后，导 入宿主使产生(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公 开号W092-19759)。使用该公知的方法，可以得到对本发明有用的嵌 合抗体。人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体或人型化抗体，其是 将人以外的哺乳动物(例如小鼠)抗体的互补决定区(CDR)移植到 人抗体的互补决定区的抗体，其通常的基因重组方法也是众所周知的 (参照欧洲专利申请>^开号EP125023、国际专利申请7>开号WO 92-19759)。具体而言，通过PCR法由多个寡核苷酸合成DNA序列，所述DNA 序列是以连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR; framework region)的形式设计的，所迷寡核普酸是以在末端部具有重叠部分的形 式制作的。将所得的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后插入 表达栽体，将其导入宿主，以使产生而得到人源化抗体(参照欧洲专 利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号W092-19759)。通过CDR连接的人抗体的FR是可以选择的，以便互补决定区形 成良好的抗原结合部位。根据需要，可以取代抗体的可变区的构架区 的氨基酸，以使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位， (Sato， K. " flZ" Cancer Res. (1993) 53， 851-856)。对于嵌合抗体、人源化抗体，使用人抗体C区。作为人抗体C区， 可列举Cy，例如可以使用O/l, C/2, Cy3或Cy4。另外，为了改善抗 体或其生产的稳定性，还可以对人抗体C区进行修饰。抗体的C区构成，另外人源化抗体由来源于人以外的哺乳动物的抗体 的互补决定区和来源于人抗体的构架区以及C区构成，它们在人体内 的抗原性低下，因此作为本发明中所用的抗体是有用的。作为本发明中使用的人源化抗体的优选具体例，可列举人源化 PM-1抗体(参照国际专利申请公开号W092-19759)。另外，作为获得人抗体的方法，除了如前所述的方法外，还已知 使用人抗体文库，通过筛选而获得抗体的技术。例如还可以将人抗体 的可变区作为单链抗体(scFv)，利用噬菌体展示法使其在噬菌体的表面表达，进而选择结合于抗原的噬菌体。如果解析所选择的噬菌体的基因，则可以决定结合于抗原的编码人抗体可变区的DNA序列。如 果知道了结合于抗原的scFv的DNA序列，则可以制作含有该序列的 适当的表达载体，并获得人抗体。这些方法已为人所知，可以参考WO 92/01047、 WO 92/20791、 WO93/06213、 WO 93/11236、 WO 93/19172、 WO 95/01438、 WO 95/15388。如前所述构筑的抗体基因可以通过公知的方法来表达。使用哺乳 类细胞时，可以通过DNA或者含有DNA的载体来表达，所述DNA功 能性地结合于常用的有用的启动子、所表达的抗体基因、其3，侧下游的聚腺苷酸信号(求y A^^于AO 。例如作为启动子/增强子，可列 举人类巨细胞病毒即时早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer )。另外，作为其他可以用于本发明中使用的抗体表达的启动子/增强 子，可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40) 等病毒启动子/增强子或者人延伸因子la(HEFla)等来源于哺乳类细胞 的启动子/增强子。例如使用SV40启动子/增强子时，根据Mulligan等人的方法 (Mulligan, R. C. Wfl/" Nature (1979) 277， 108画114)可以容易地实施；或 者，使用HEFla启动子/增强子时，根据Mizushima等人的方法 (Mizushima， S. and Nagata S" Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)可以 容易地实施。大肠杆菌的情况，可以使常用的有用的启动子、用于抗体分泌的 信号序列、表达的抗体基因功能性结合而表达。例如作为启动子，可 以列举出lacZ启动子、araB启动子。j吏用lacZ启动子时，可以按照 Ward等人的方法(Ward， E. S. " Nature (1989) 341， 544-546; Ward, E. S. W fl/.， FASEB J. (1992) 6， 2422-2427);使用araB启动子时，可以 按照Better等人的方法(Better，M. C /.， Science(1988) 240， 1041-1043)。作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可 以使用pelB信号序列(Lei， S. P. " J. Bacteriol. (1987) 169， 4379-4383)。将周质中产生的抗体分离后，将抗体的构造适当重折叠 (refold)后使用(例如参照WO96/30394)。作为复制起点，可以使用来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点，而且为了扩增宿主细胞系中的基因 拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷 激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟噤呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt) 基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择性标记。为了制造本发明中使用的抗体，可以使用任意的产生系统(産生 系)。用于抗体制造的产生系统有体外(in vitro)和体内(in vivo) 的产生系统。作为体外的产生系统，可列举使用真核细胞的产生系 统或4吏用原核细胞的产生系统。使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生 系统。作为动物细胞，已知(1)哺乳类细胞，例如CHO、 COS、骨 髓瘤、BHK (幼仓鼠肾，baby hamster kidney) 、 HeLa 、 Vero等；(2 ) 两栖类细胞，例如爪蟾卵母细胞(Xert印w oocyte);或者(3)昆虫 细胞，例如sf9、 sf21、 Tn5等。作为植物细胞，已知有来源于烟草 (Nicotiana tabaciim)的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真 菌细胞，已知有酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母 菌(Saccharomyces cerevisiae);线状菌，例如曲霉属(Aspergillus)， 例如黑曲霉(Aspergillus niger )等。使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞， 已知大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌。通过下迷方法得到抗体利用转化将目标抗体基因导入这些细胞 中，并在体外培养所转化的细胞。可以根据公知的方法进行培养。例 如，作为培养液，可以使用DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM,也 可以并用胎牛血清(FCS)等血清补充液。另外，通过将导入有抗体基 因的细胞移至动物的腹腔等，从而也可以在体内产生抗体。另一方面，作为体内的产生系统，可以列举出使用动物的产生系 统或使用植物的产生系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的 产生系统等.作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(ViekiGlaser， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。另外，作为昆虫，可 以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。将抗体基因导入这些动物或植物中，在动物或植物体内产生抗体， 并回收。例如，可以在编码蛋白质的基因中间插入抗体基因而作为融合基因制备，所述蛋白质是在山羊p酪蛋白之类的乳汁中固有产生的。将含有融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎(所迷融合基因中插入有 抗体基因)，将该胚胎导入雌性的山羊。由接受胚胎的山羊生产的转 基因山羊或其子孙所产生的乳汁得到所需的抗体。为了使含有所需抗 体的乳汁量增加，也可以对转基因山羊使用适当的激素，其中所需抗 体是由转基因山羊产生的。(Ebert， K. M. Bio/Technology (1994) 12,699-702 )。另外，使用蚕时，使蚕感染插入有目标抗体基因的杆状病毒，由该 蚕的体液得到所需的抗体(Maeda， S. W a/.， Nature (1985) 315， 592-594)。而且，使用烟草时，将目标抗体基因插入植物表达用载体 (例如pMON530)，将该栽体导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens )之类的细菌。4吏该细菌感染烟草(例如Nicotiana tabacum )，从该烟草的叶子中得到所需的抗体(Julian, K. -C. Ma " Eur. J. Immunol. (1994) 24， 131-138 )。如上所述利用体外或体内的产生系统产生抗体时，可以将编码抗 体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别插入表达栽体，使宿主同 时转化；或者也可以将编码H链和L链的DNA插入单一的表达载体， 使宿主转化(参照国际专利申请公开号WO 94-11523)。本发明中使用的抗体，只要可以适用于本发明即可，可以是抗体 的片段或其修饰物。例如，作为抗体的片段，可列举Fab、 F(ab，)2、 Fv或用适当的连接体使H链和L链连接的单链Fv (scFv)。具体而言，将抗体用酶(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)进行处理， 生成抗体片段，或者构筑编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载 体后，在适当的宿主细胞中表达(例如，参照Co, M. S. W a/.， J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M. & Horwitz， A. H.， Methods in Enzymology (1989) 178， 476-496; Plueckth叫A. & Skerra， A.， Methods in Enzymology (1989) 178， 497-515; Lamoyi， E.， Methods in Enzymology (1989) 121， 652-663; Rousseaux, J. W Z" Methods in Enzymology (1989) 121， 663-666; Bird, R. E. C "/ ， TIBTECH (1991) 9， 132-137)。scFv通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。该scFv中， H链V区和L链V区通过连接体(优选通过肽连接体)进行连接(Huston，J.S et al; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。 scFv中 的H链V区和L链V区也可以来源于作为上述抗体记载的任一种抗体。 作为连接V区的肽连接体，例如可以使用由氨基酸12-19残基构成的 任意单链肽。编码scFv的DNA,可以通过以下方法获得以编码前述抗体的H 链或H链V区的DNA,以及编码L链或L链V区的DNA作为模板， 将编码这些序列中所需的氨基酸序列的DNA部分，使用规定其两端的 引物对，利用PCR法进行扩增，然后，进一步组合编码肽连接体部分 的DNA以及为使其两端分别与H链、L链连接而规定的引物对，并进 行扩增。另外， 一旦编码scFv的DNA被制成，就可以根据常法得到含有 它们的表达载体以及由该表达载体而转化的宿主，另外，使用该宿主 根据常法可以得到scFv。这些抗体的片段，可以与前述同样来获得其基因并使其表达，再 通过宿主而产生。本发明中所说的"抗体"中也包括这些抗体的片段。作为抗体的修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子 结合的抗体。本发明中所说的"抗体，，中也包括这些抗体修饰物。为了 得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得抗体实施化学修饰而得到。 这些方法在该领域中是已经确立的。如上述那样产生、表达的抗体，可以自细胞内外、宿主分离，并 纯化至均一。本发明中所用的抗体的分离、纯化可以利用亲和色镨法 进行。作为亲和色谱法中使用的柱，例如可列举蛋白质A柱、蛋白 质G柱。作为蛋白质A柱中所用的载体，例如可列举Hy perD 、 POROS 、 S印haroseF.F.等。另外可以使用通常的蛋白质所用的分离、纯化方法， 并没有任何限定。例如，可以适当选择、组合除上述亲和色谱法以外的色谱法、过 滤、超滤、盐析、透析等，来分离、纯化本发明中使用的抗体。作为 色谱法，例如可列举离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤等。 这些色谱法适用于HPLC(高效液相色谱法，high performance liquid chromatography),另外还可以4吏用反相HPLC( reverse phase HPLC )。上述得到的抗体的浓度测定可以通过吸光度测定或ELISA等而进 行。即，通过吸光度测定的情况下，用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，以1 mg/ml作为1.35 OD来计算。另外，使用ELISA的情 况下，可以如下述那样进行测定。即，在96孑L板(Nunc制)中加入用0.1M 重碳酸緩冲液(pH 9.6)稀释至ljig/ml的山羊抗人IgG (TAG制)100pl， 在4t:下孵化一晚，使抗体固相化，阻断后，添加适当稀释的本发明中 所用抗体或含有抗体的样品，或者作为标准品的人IgG (CAPPEL 制)100jd,在室温下孵化1小时，洗净后，加入稀释5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG (BIO SOURCE制)100nl，室温下孵化1小时，洗净后加入基质溶液，孵化 后，使用微量培养板读数模型3550 ( MICROPLATE READER Model 3550 ) (Bio-Rad制)测定405nm下的吸光度，算出目标抗体的浓度。本发明中使用的IL-6变体是具有与IL-6受体的结合活性，且不传 导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6变体与IL-6对IL-6受体竟争 性结合，但不传导IL-6的生物学活性，因此可以阻断IL-6引起的信号 传导。IL-6变体通过取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基而引入突变进 而制得。构成IL-6变体的基础的IL-6,不管其来源，若考虑抗原性等， 则优选为人IL-6。具体而言，通过以下方法进行制备将IL-6氨基酸序列使用公知 的分子建模程序，例如WHATIF(Vriend " fl/.， J. Mol. Graphics (1990) 8， 52-56)来预测其二级结构，进而评价对取代的氨基酸残基全体的影 响。决定适当的取代氨基酸残基后，以含有碱基序列的载体作为模板 (所述碱基序列是编码人IL-6基因的碱基序列)，通过通常进行的PCR 法引入突变，以使氨基酸被取代，从而得到编码IL-6变体的基因。根 据需要将其插入适当的表达载体，基于前述重组抗体的表达、产生以及纯化方法可以得到IL-6变体。作为IL-6变体的具体例，公开有Brakenhoff " "/ ， J. Biol. Chem. (1994) 269， 86-93，以及Savino " /" EMBO J. (1994) 13， 1357-1367、 WO 96-18648， WO 96-17869。本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是分别具有与IL-6 受体或IL-6的结合活性，且不传导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6 部分肽或IL-6受体部分肽结合于IL-6受体或IL-6，通过捕捉它们，从 而特异性地阻断IL-6与IL-6受体的结合。其结果为，由于不传导IL-6的生物学活性，因而阻断IL-6引起的信号传导。IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，是由IL-6或IL-6受体的氨基酸 序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关的区域的一部分或全部的氨基酸 序列构成的肽。这种肽通常由10 80，优选20-50，更优选20 40个氨 基酸残基构成。IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，可以通过通常7>知的方法，例如 基因工程方法或肽合成法进行制作，即在IL-6或IL-6受体的氨基酸序 列中，确定与IL-6和IL-6受体结合相关的区域，以该确定区域的一部 分或全部的氨基酸序列为基础的方法。使用基因工程方法制作IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，将编码 所需的肽的DNA序列插入表达载体，根据前述重组抗体的表达、产生 以及纯化方法可以制得。4吏用肽合成法制作IL-6部分肽或1L-6受体部分肽时，可以4吏用在 肽合成中常用的方法，例如固相合成法或液相合成法。具体而言，可以根据"续医药品的开发第14巻肽合成监修矢岛 治明广川书店1991年"中记载的方法进行。作为固相合成法，例如可 以使用以下方法在不溶于有机溶剂的支撑体上结合对应于要合成的 肽的C末端的氨基酸，通过交替重复以下的反应来拉伸肽链，所述反 应为将氨基酸按照从C末端到N末端方向的顺序使每个氨基酸进行 缩合的反应，所述氨基酸是用适当的保护基保护a-氨基酸和側链官能 团的氨基酸；以及(2)使结合在树脂上的氨基酸或肽的a-氨基酸的该 保护基脱离的反应。固相肽合成法根据所用的保护基的种类，大致分 为Boc法和Fmoc法。这样合成目标肽之后，进行脱保护反应以及从肽链的支撑体的切 断反应。在与肽链的切断反应中，Boc法通常可以使用氟化氢或三氟曱 磺酸；Fmoc法通常可以使用TFA。 Boc法中，例如在氟化氢中在苯甲 醚存在下，处理上述保护肽树脂。然后，进行保护基的脱离和从支撑 体的切断，来回收肽。通过将其冷冻干燥而得到粗肽。另一方面，Fmoc 法中，例如在TFA中按照与上述同样的操作进行脱保护反应和从肽链 支撑体的切断反应。得到的粗肽可以采用HPLC来分离、纯化。其溶出可以使用蛋白 质纯化中常用的水-乙腈系溶剂，在最适条件下进行。分取对应于所得图谱的特性峰的组分，将其进行冷冻干燥。对于这样纯化的肽组分， 通过质谱分析来进行分子量解析、氨基酸组成分析或氨基酸序列解析 等，从而进行鉴定。IL-6部分肽以及IL-6受体部分肽的具体例，已在日本特开平 2-188600、日本特开平7-324097、日本特开平8-311098以及美国专利 公报US5210075中公开。本发明中使用的抗体，也可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物 质、毒素等各种分子结合的共轭抗体(3y^-^—h抗体)。这样 的共辄抗体可以通过对所得到的抗体实施化学修饰而得到。另外，抗 体的修饰方法在该领域中已经确立。本发明中的"抗体"中也包含这些 共轭抗体。本发明的心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂可 以用于心肌梗塞的治疗。在本发明中，"心肌梗塞治疗"是指抑制或预防心肌梗塞的症状以 及心肌梗塞中并发的心力衰竭、缺血引起的重度心律不齐。作为心肌梗塞中并发的症状，可列举心律不齐(期外收缩、心 室纤维性颤动、房室传导阻滞)、心力衰竭、乳头肌断裂、心破裂、 心室瘤(作为左冠动脉前降支梗塞的结果在心尖部生成)、心肌梗塞 后症候群等，本发明的"心肌梗塞治疗剂"也可以抑制、预防这些症状。另外，在本发明中，"心肌梗塞后左心室重塑的抑制"是指抑制或 预防心肌梗塞后用于弥补梗塞区的功能降低的心肌肥大(左心室全体 扩张)。该心肌肥大，是由于梗塞区的心肌细胞坏死、脱落，被置换成胶 原纤维等纤维组织，纤维组织薄且伸展而引起的。因此抑制、预防"置 成换梗塞区的胶原纤维"以及"纤维组织的伸展，，，即改善梗塞区的状 态，也包含在上述的"心肌梗塞后左心室重塑的抑制"中。确认心肌梗塞的症状以及心肌梗塞后的左心室重塑是否被抑制， 可以以心肌梗塞区以及非梗塞区的髓过氧化物酶(MPO)活性作为指标 进行判断。已知髓过氧化物酶(MPO)是噬中性粒细胞的细胞内颗粒中 存在的酶，如果有冠动脉疾病，则活性会显著地上升。随着梗塞区的 扩大以及恶化(坏死等)，使MPO活性增加。即通过给予本发明的药 物，从而在MPO活性被抑制的情况下，可以认为心肌梗塞的症状以及22心肌梗塞后的左心室重塑被抑制。MPO活性可以根据公知的方法进行 测定，例如可以列举出实施例中记载的测定方法。另外，确认心肌梗塞的症状以及心肌梗塞后的左心室重塑是否被 抑制，也可以以心肌梗塞区以及非梗塞区的MCP-1 (单核细胞趋化蛋白 國l， monocyte chemoattractant protein-l)的表达作为指才示进4亍判断。已 知MCP-1是在心肌内诱导巨噬细胞，通过炎症性细胞因子的表达亢进 而成为心力衰竭发病原因的趋化因子，使炎症活化、引起血管周围或 心肌的纤维化。随着梗塞区的扩大以及恶化(坏死等)，MCP-1的表 达增大。即，MCP-1的表达被抑制时，可以认为心肌梗塞的症状以及 心肌梗塞后的左心室重塑被抑制。MCP-1的表达可以使用公知的蛋白 质表达测定方法进行测定，例如可以列举出蛋白质印迹法或ELISA法 等。抑制MPO活性以及抑制MCP-1的表达，均意味着上述的"改善梗 塞区的状态"。进而，通过心脏超声波检查来测定左心室扩张末期径(径)以及 射血分数，或者通过心脏组织的组织学检查来对心肌纤维化的程度或 心肌细胞肥大进行定量评价，从而也可以判断心肌梗塞的症状以及心 肌梗塞后的左心室重塑是否被抑制。这些可以通过公知的方法来实施。 例如可以列举出实施例中记载的方法。本发明中使用的IL-6抑制剂的IL-6信号转导抑制活性，可以通过 通常使用的方法进行评价。具体而言，通过培养IL-6依存性人骨髓瘤 林(S6B45， KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3、或IL-6依存 性细胞MH60.BSF2，在其中添加IL-6，同时共存有IL-6抑制剂，从而 可以测定IL-6依存性细胞的SH-胸腺嘧啶核苷摄取。另外，通过培养 IL-6受体表达细胞U266，添加125I标记IL-6，同时加入IL-6抑制剂， 从而测定结合于IL-6受体表达细胞的1251标记IL-6。上述检测系统中， 除了存在IL-6抑制剂的组，还有不含IL-6抑制剂的阴性对照组，比较 两者中得到的结果，则可以评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。如后述的实施例中所述，通过给予抗IL-6受体抗体，从而可以确 认抑制心肌梗塞的症状和心肌梗塞后的左心室重塑，因此可知抗IL-6 受体抗体等的IL-6抑制剂作为心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室 重塑的抑制剂是有用的。本发明的心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室重塑抑制剂的给 药对象是哺乳动物。哺乳动物优选为人。本发明的心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂， 可以以药品的形态给药，可以口服或非口服的全身或局部给药。例如 可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、 栓剂、灌肠剂、口服肠溶制剂等，可以根据患者的年龄、症状等来选择适当的给药方法。有效给药量每次每lkg体重在0.01mg 100mg的范 围内选择。或者每个患者选择l-1000mg，优选5~50mg的给药量。优 选的给药量、给药方法，例如在抗IL-6受体抗体的情况下，血中游离 抗体存在的程度的量为有效给药量，作为具体的例子，每lkg体重1 个月(4周)0.5 mg 40 mg，优选1 mg~20 mg，分1次 数次给药，例 如2次/周、l次/周、l次/2周、1次/4周等按照给药时间表用点滴等静 脉注射、皮下注射等方法进行给药的方法。给药时间表，可以一边观 察移植后的状态以及观察血液检查值的动向， 一边进行延长给药间隔 等调整，如从2次/周或l次/周调整为l次/2周、l次/3周、l次/4周。在本发明中心肌梗塞治疗剂以及心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂 中，也可以添加保存剂、稳定剂等制剂上容许的载体。制剂上容许的 载体是指其自身可以是对上述心肌梗塞症状以及心肌梗塞后的左心室 重塑具有抑制效果的材料，也可以是不具有该抑制效果的材料，可与 上述药物同时给药的材料。另外，也可以是对心肌梗塞症状以及心肌 梗塞后左心室重塑具有抑制效果的材料，通过与IL-6抑制剂并用，从 而具有协同或相加的稳定效果的材料。作为制剂上容许的材料，例如可列举灭菌水、生理盐水、稳定 剂、赋性剂、緩冲剂、防腐剂、表面活性剂、络合剂(EDTA等)、 粘合剂等。本发明中，作为表面活性剂可以列举出非离子表面活性剂，例如 可以列举出以下物质作为典型的例子失水山梨醇单辛酸酯、失水山 梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯等失水山梨醇脂肪酸酯；单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯等甘油脂肪酸酯； 单硬脂酸十聚甘油酯、双硬脂酸十聚甘油酯、单亚油酸十聚甘油酯等 聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山 梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯失水山梨醇四 硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪 酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇 二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂醚等聚氧乙烯烷基醚； 聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙 烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基酚醚等聚氧 乙烯烷基酚醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢 化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯失水山梨醇蜂蜡等聚氧 乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6-18的物质等。另外，作为表面活性剂也可以列举出阴离子表面活性剂，例如可 以列举出以下物质作为典型的例子十六烷基硫酸钠、月桂基疏酸钠、 油烯基疏酸钠等具有碳原子数10~18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯 月桂基硫酸钠等氧化乙烯的平均加成摩尔数为2~4、烷基碳原子数 10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基琥珀酸酯钠等烷基碳原子 数为8 18的烷基磺基琥珀酸酯盐；天然的表面活性剂，例如卵磷脂、 甘油磷脂；神经鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子数12~18的脂肪酸的蔗糖脂 肪酸酯等。本发明的药剂中可以组合添加这些表面活性剂的 一 种或两种以 上。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂为聚山梨醇酯20， 40， 60或80等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，特别优选的是聚山梨醇酯 20和80。另外，也优选以泊洛沙姆(Pluronic F-68 (注册商标)等)为 代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。表面活性的添加量根据使用的表面活性剂的种类而不同，当为聚山 梨醇酯20或聚山梨醇酯80时， 一般为0.001 100mg/ml,优选为 0.003~50mg/ml,进一步优选为0.005~2 mg/ml。作为本发明中的緩冲剂，可以列举出磷酸、柠檬酸緩冲液、醋酸、 苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡萄糖酸、癸酸、去氧胆 酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等其他的有机酸等，或者碳酸緩冲液、 三羟曱基氨基曱烷緩冲液(Tris緩冲液)、组氨酸緩冲液、咪唑緩沖 液等。另外也可以通过溶解在溶液制剂领域中公知的水性緩冲液中来制备溶液制剂。緩冲液的浓度一般为l~500mM，优选为5~100mM，进一步 优选为10~20mM。另外，本发明的药剂也可以含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白等蛋白质、氨基酸、多糖以及单糖等糖类或碳水化 合物、糖醇。作为本发明中的氨基酸，可以列举出碱性氨基酸，例如精氨酸、赖 氨酸、组氨酸、鸟氨酸等或者这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷 酸盐的形式，即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，优选pH值通过添 加适当的生理上容许的緩冲物质(例如无机酸，特别是盐酸、磷酸、 硫酸、醋酸、蚁酸或者它们的盐)来进行调节。这种情况下使用磷酸 盐时，特別是在获得稳定的冷冻干燥物方面是特别有利的。当制备物 实质上不含有机酸(例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸 等)时或者不存在相应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸 离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时，是特别有利。优选的氨基酸 为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。而且也可以使用酸性氨基酸， 例如谷氨酸和天冬氨酸及其盐的形式(优选钠盐)；或者中性氨基酸， 例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，半 胱氨酸或丙氨酸；或者芳香族氨基酸，例如苯基丙氨酸、酪氨酸、色 氨酸或衍生物N-乙酰基色氨酸。在本发明中，作为多糖以及单糖等糖类或碳水化合物，例如可列 举右旋糖苷、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、 海藻糖、棉子糖等。在本发明中，作为糖醇，例如可列举甘露醇、失水山梨醇、纤 维醇等。将本发明的药物制成注射用水溶液时，例如可以与含有生理盐水、 葡萄糖或其他辅助药(例如D-失水山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯 化钠)的等渗液混合，另外该水溶液也可以与适当的溶解辅助剂(例 如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子表面活性剂(聚 山梨醇酯80、 HCO-50)等)并用。根据需要还可进一步含有稀释剂、溶解辅助剂、pH调节剂、无痛 剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。本发明中，作为含硫还原剂，例如可列举N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫 代失水山梨醇、巯基乙酸及其盐、疏代硫酸钠，谷胱甘肽以及碳原子数 1 7的硫代直链烷酸等具有巯基的物质等。另外，作为本发明中的抗氧化剂，例如可列举异抗坏血酸、二 丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、a-生育酚、生育盼乙酸酯、L-抗坏 血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢 钠、亚硫酸钠、三戊基没食子酸酯、丙基没食子酸酯或乙二胺四乙酸 二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等络合剂。另外，根据需要，也可以通过封入微胶嚢(羟甲纤维素、明胶、聚[甲 基丙烯酸曱酯等微胶嚢)，制成胶体药物传递系统(脂质体、白蛋白微 球、微乳、纳米粒和纳米胶嚢等)(参照"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed.， 1980等)。而且将药物制成緩释制剂的方 法也是>^知的，也可适用于本发明(Langer " J. Biomed. Mater. Res. 1981， 15: 167-277; Langer， Chem. Tech. 1982， 12: 98-105;美国专利第 3，773，919号；欧洲专利申请^i^开(EP)第58,481号；Sidman & Biopolymers 1983， 22: 547-556; EP第133,988号)。所用的制剂上容许的载体，可根据剂型从上述中适宜选择或进行 组合，但并不局限于这些。本发明涉及对对象治疗心肌梗塞的方法以及抑制心肌梗塞后左心 室重塑的方法，其中治疗方法包括将IL-6抑制剂给予有心肌梗塞症状 的对象的工序。在本发明中，"对象"是指给予本发明的心肌梗塞治疗剂以及心肌 梗塞后左心室重塑抑制剂的生物体、该生物体体内的一部分。生物体 没有特别地限定，包含动物(例如人、家畜动物种、野生动物)。另外，"生物体体内的一部分"没有特别限定，可优选列举心脏、 心肌、心肌梗塞的梗塞区或非梗塞区等。在本发明中，"给药，，包括口服或者非口服给药。作为口服给药， 可以列举出以口服制剂的形式给药，作为口服制剂，可以选择颗粒剂、 散剂、片剂、胶嚢剂、溶液剂、乳剂或悬浊剂等剂型。作为非口服给药，可以列举出以注射剂形式给药，作为注射剂，可以列举出皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。另外，通过使用基因治疗方法将包含应给予的寡核苷酸的基因导入机体，可以达 到本发明方法的效果。另外，本发明的药剂也可以对需实施处置的区 域进行局部给药。例如也可以通过手术中的局部注入、使用导液管或本发明的编码肽的DNA的定向基因送递而进行给药。心肌梗塞发病时 的处方，例如也可以与导液管手术法(PTCA、 PCI)、血栓溶解疗法 (PTCR)、冠状动脉旁路移植术(CABG)等同时平行地给予本发明的药 剂。实践本发明的方法时，本发明的药剂也可以与至少一种已知的化 学疗法剂 一起作为药学组合物的一部分进行给药。或者本发明的药剂 与至少一种已知的免疫抑制剂同时给药。在一种方式中，本发明的药 剂和已知的化学疗法剂可以实质上同时给药。另外，本说明书中引用的全部背景技术文献作为参考包括在本说 明书中。实施例下面，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不局限 于这些实施例。实施例1制作心肌梗塞小鼠模型对雄性Balb/c小鼠(2S 30g)进行气管插管，安装人工呼吸器，在 异氟烷0.5~1.0°/。的条件下进行吸入麻醉。从左侧开胸，结扎左前降支 后闭胸。将小鼠分为MR16-1给药组(MR16-1组)和非给药组(对照组)， 对MR16-1给药组腹腔注射500ng/只(body)的MR16-1。[实施例21MPO活性测定心肌梗塞制成(冠状动脉结扎)2天后摘出小鼠心脏，分成梗塞区 和非梗塞区并切碎。然后在切碎的心肌中加入10倍量的含0.5"/o十六烷 基三曱基溴化铵的50 mM KP04緩冲液(pH 6.0)，均质化后 (POLYTRON， KINEMATICAAG， Luzern， Switzerland)进行超声波粉 碎。将提取液在13,000 rpm、 4。C下离心分离10分钟。将得到的上清 液50pl与基质溶液1.45 ml (50 mM KP04 (pH 6.0)、 0.167 mg/ml邻联 茴香胺二氢氯化物(o画dianisidine dihydrochloride ) 、 0.005% 11202)混 合后，在460nm的吸光度下测定基质溶液颜色的变化(衰减系数 (Extinction Coefficient) =2.655)。其结果为，心肌MPO活性在sham组心肌和心肌非梗塞区存在差异，但在心肌梗塞区显著增加至约4倍(非控制风险(control-nonrisk) 0.037 ± 0.006;控制风险(control-risk) 0.122 ± 0.035; p<0.01)。而且 在MR16-1给药組中，该心肌梗塞区的MPO活性增加被显著抑制 (MR16-1画风险0.034 士0.008;与控制风险(control-risk)相比p<0.05 )。 [实施例3MCP-1表达测定心肌梗塞制成2日后摘出小鼠的心脏，分成梗塞区和非梗塞区并 切碎。在切碎的心室肌中加入裂解緩冲液(lysis buffer) (2 x PBS， 1% NP-40, 0.5%去氧胆酸钠(sodium deoxycholate ) ， 0.1%十二烷基疏酸 钠(sodium dodecylsulphate ) ，lmMPMSF，l%蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (protease inhibitor cocktail) (/于力，亍7夕))进行均质化。将这些 提取液在13，000 rpm、 4。C下离心分离10分钟，将所得上清液制成总 细胞裂解液(total cell lysate),用Lowry法进行蛋白质定量。用12% 聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质溶液，转录到Immun-BlotTM PVDF 膜上。之后使用抗MCP-1抗体(l:30;IBLCo.)作为一次抗体，在4。C下 过夜，进而使用山羊抗家兔(goat anti-rabbit )IgG (1:400;细胞信号 传导)作为二次抗体在室温下反应2小时，使用ECL (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, U.K.)的化学发光法检测MCP-1表达。使 用计算机软件(Scion Image Frame Grabber Status)对照片进行图像解 析。其结果为，心肌MCP-1表达在对照组中心肌梗塞区、非梗塞区均 增加，但在梗塞区更显著。而且，MCP-1给药组中在两区域该MCP-1 增加均纟皮抑制。[实施例4心脏超声波检查心肌梗塞制成4周后，在麻醉下对心脏进行心脏超声波检查，测 定左心室舒张末期径和左心室径缩短率(FS)。其结果为，心肌梗塞制成4周后的心脏超声波检查中，左心室舒 张末期径在对照组中比sham组显著增加。该左心室径的增加通过给予 MR16-1而被显著抑制。而且FS通过制成心肌梗塞而减少，但通过给 予MR16-1而显著改善(对照组18.5 ± 2.9%对比MR16-1组28.5 ± 1.8%; p<0.05)。[实施例5组织学评价心肌梗塞制成4周后摘出心脏，用4%多聚曱醛磷酸緩沖液固定，Masson，s三色染色，对非梗塞区的心肌 纤维化程度以及心肌短轴断面中的心肌细胞肥大进行定量评价。其结果为，在心肌非梗塞区，对照组中发现心肌细胞的肥大、间 质的纤维化，相对而言MR16-1给药组中这些症状被抑制。工业适用性心肌梗塞如果梗塞区扩大、恶化，则有时并发心力衰竭，或由缺 血引起重度的心律不齐，对生命有很高的危险性。本发明的心肌梗塞 治疗剂、心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂以及通过治疗或预防心肌梗 塞的方法，从而可以对心肌梗塞中并发的症状进行抑制，进行有效地 治疗。认为心肌梗塞后左心室重塑的发病率也与梗塞区的大小有关，从 心肌梗塞发病初期，改善梗塞区的状态，防止其扩大是很重要的。认 为通过以本发明的IL-6抑制剂作为有效成分的药物从心肌梗塞初期开 始对患者给药，从而可抑制心肌梗塞中并发的症状和左心室重塑。
权利要求
1.一种心肌梗塞治疗剂，其含有IL-6抑制剂作为有效成分。
2. 根据权利要求1所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，IL-6抑 制剂是识别IL-6的抗体。
3. 根据权利要求1所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，IL-6抑 制剂是识别IL-6受体的抗体。
4. 根据权利要求2或3所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗 体是单克隆抗体。
5. 根据权利要求2或3所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗 体是抗人IL-6的抗体或者抗人IL-6受体的抗体。
6. 根据权利要求2或3所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗 体是重组抗体。
7. 根据权利要求6所述的心肌梗塞治疗剂，其特征在于，抗体是 嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
8. —种心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂，其含有IL-6抑制剂作为 有效成分。
9. 根据权利要求8所述的抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识 别IL-6的抗体。
10. 根据权利要求8所述的抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识 别IL-6受体的抗体。
11. 根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，抗体是单 克隆抗体。
12. 根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，抗体是抗 人IL-6的抗体或者抗人IL-6受体的抗体。
13. 根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，抗体是重 组抗体。
14. 根据权利要求13所述的抑制剂，其特征在于，抗体是嵌合抗 体、人源化抗体或人抗体。
15. 根据权利要求8 ~ 14中任一项所述的抑制剂，其用于心肌梗塞 的治疗。
16. 对对象治疗心肌梗塞的方法，其包含对有心肌梗塞症状的对象 给予IL-6抑制剂的工序。
17. 对对象抑制心肌梗塞后左心室重塑的方法，其包含对有心肌梗 塞症状的对象给予IL-6抑制剂的工序。
18. 根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，IL-6抑制剂 是识别IL-6的抗体。
19. 根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，IL-6抑制剂 是识别IL-6受体的抗体。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，抗体是单克 隆抗体。
21. 根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，抗体是抗人 IL-6的抗体或者抗人IL-6受体的抗体。
22. 根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，抗体是重组 抗体。
23. 根据权利要求22所述的方法，其特征在于，抗体是嵌合抗体、 人源化抗体或人抗体。
24. IL-6抑制剂在制造心肌梗塞治疗剂中的用途。
25. IL-6抑制剂在制造心肌梗塞后左心室重塑的抑制剂中的用途。
26. 根据权利要求24或25所述的用途，其特征在于，IL-6抑制剂 是识别IL-6的抗体。
27. 根据权利要求24或25所述的用途，其特征在于，IL-6抑制剂 是识别IL-6受体的抗体。
28. 根据权利要求26或27所述的用途，其特征在于，抗体是单克 隆抗体。
29. 根据权利要求26或27所述的用途，其特征在于，抗体是抗人 IL-6的抗体或者抗人IL-6受体的抗体。
30. 根据权利要求26或27所述的用途，其特征在于，抗体是重组 抗体。
31. 根据权利要求30所述的用途，其特征在于，抗体是嵌合抗体、 人源化抗体或人抗体。
全文摘要
本发明人对于抗IL-6受体抗体改善心肌梗塞中梗塞区状态的效果，以及抑制心肌梗塞后左心室重塑的效果进行了研究。其结果为，通过给予抗IL-6受体抗体，从而在心肌梗塞区MPO活性的增加被显著抑制。另外，心肌MCP-1的表达在心肌梗塞区和非梗塞区被抑制。而且通过心脏超声波检查、组织学检查而明确心脏肥大被抑制。
文档编号A61K39/395GK101330930SQ20068004753
公开日2008年12月24日 申请日期2006年10月20日 优先权日2005年10月21日
发明者小原幸 申请人:中外制药株式会社