基于ctab法快速提取动物粪便基因组的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，属于生物技术 领域。 技术背景
[0002] 在动物的身体里，有无数微小的生物时时刻刻与动物同呼吸、共命运。它们就是存 在于动物肠道内的大量微生物群。已有研宄发现，肠道微生物与免疫系统有着密切的关系。 2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成， 如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有 可能出现自体免疫疾病等病态变化。研宄者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自 体免疫疾病症状的新方法。同时2011年有研宄发现，每个人在其消化道中都有一个领导菌 群的主导菌种，人类可以根据其微生物特征而划分为3种不同的"肠类型"。这一发现可帮 助厘清健康和疾病状态时饮食、微生物、身体之间的相互作用。该成果入选了当年《科学》杂 志评选的十大科学进展。
[0003] 科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是 微生物的多样性程度。例如：印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生 物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研宄还发现， 尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似 性。如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6-9个月的时 间来获得第一组6-700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研宄 还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一 变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。
[0004] 动物肠道微生物内的微生物的多样性对研宄肠道微生物与动物健康有着重大关 系。研宄肠道微生物的多样性就要求我们能从动物的粪便中提取到微生物的基因组，从而 对其多样性进行研宄，本发明提供一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，利 用该试剂盒能够方便、快捷地提取动物粪便微生物基因组。
【发明内容】
： 本发明提供一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，该试剂盒在破碎细 胞后先用CTAB溶液去除蛋白杂质，同时利用硅胶模吸附柱吸附柱吸附基因组DNA，最后在 采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去剩余的蛋白等杂质，利用该试剂盒可以快速提取到动物 粪便微生物基因组。
[0006] 一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，包括粪便的前处理、粪便中 微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA 洗脱，具体步骤如下： 奠便的前处理：称取0.3-0. 5g新鲜奠便于2ml离心管中，加入l-2ml Buffer A振荡 l_2min，3000-5000rpm/min 离心 10_20min，转移上清至新的离心管中，10000-12000rpm/ min离心10_20min。弃上清，保留沉淀。
[0007] 粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450-600 μ I Buffer B和50-60 μ 1 Buffer C，混匀后 37-40°C水浴 l_2h，加入65-70 μ I Buffer D 和 65-70 μ I Buffer Ε，混匀 后 37-60°〇水浴1_211。加入 100-20(^181^€61?和50-10(^181^€616溶液，65-80°〇 水浴 10_20min。
[0008] DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600-800 μ I Buffer H，振荡器震荡 30_60s后，12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的 Buffer I，12000-13000rpm/min离心10_20min，将上清移至新的离心管中。
[0009] DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后 加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液，加入500-600 μ 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 离心 l-2min，弃废液，加入 300-500 μ 1 漂洗液，12000-13000rpm/min 离心l-2min，弃废液，加入500-600 μ 1漂洗液，12000-13000rpm/min离心l-2min，弃废液， 12000-13000rpm/min 离心 l_2min，静置吹干。
[0010] DNA 洗脱：往吸附柱中加入 30-60 μ 1 洗脱液，12000-13000rpm/min 离心 l-2min， 所得液体为粪便微生物基因组。取3-6 μ I DNA水溶液，于1-2%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0011] 试剂的配方如下： DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
[0012] Buffer A :0· 25-0. 37mol/L 磷酸二氢钾，0· 175-0. 2mol/L 氢氧化钠 ，PH = 7-8〇
[0013] Buffer B :10-20mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris)，I-IOmM 乙二胺四乙酸（EDTA)，PH =5. 0-8. 0〇
[0014] Buffer C : 10_50mg/ml 的溶菌酶。
[0015] Buffer D: 20_50mg/ml 的蛋白酶 K。
[0016] Buffer E: 10-20 % 的十二烷基硫酸钠（SDS)。
[0017] Buffer F:3-8mol/L 的氯化钠（NaCL) 〇
[0018] Buffer G:0. 14-0. 28mol/L 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，0. 5-lmol/L 氯化钠 (NaCL)〇
[0019] Buffer H:酷：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0020] Buffer I:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0021] 沉淀剂：70-80 %无水乙醇。
[0022] 去蛋白液：3-6厘盐酸胍，10-30禮三羟甲基氨基甲烷（1'1^)，？!1 = 6.0-7.0，用前 加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为30-40 %。
[0023] 漂洗液：20-50mM 氯化钠（NaCL)，2-5mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0-8. 0， 80-90%比重无水乙醇。
[0024] 洗脱液：10-20mM三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 8. 0-9. 0。
[0025] 本发明的显著优点： 一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，该试剂盒在破碎细胞后先用 CTAB溶液去除蛋白杂质，同时利用硅胶模吸附柱吸附柱吸附基因组DNA，最后在采用特有 的去蛋白液和漂洗液洗去剩余的蛋白等杂质。常规的动物粪便微生物基因组提取方法需要 14h以上的时间，长时间的操作容易造成基因组的降解。与常规的动物粪便微生物基因组提 取方法相比，该试剂盒仅需4h即可提取到动物粪便基因组，不仅节省了大量提取时间，同 时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到动物粪便微生物基因组。
【附图说明】： 图1为利用试剂盒提取的动物粪便微生物基因组的电泳检测图。 具体实施例
[0027] 图1中，泳道1，2是利用本试剂盒提取到的动物粪便微生物基因组，泳道3为 TAKARA 公司的 DL4500 Marker。
[0028] 一种基于CTAB法快速提取动物粪便基因组的试剂盒，具体步骤如下： (1)奠便的前处理：分别称取两管〇. 3g新鲜奠便于2ml离心管中，加入1ml Buffer A 振荡lmin，3000rpm/min离心10min，转移上清至新的离心管中，10000rpm/min离心10min。 弃上清，保留沉淀。
[0029] (2)粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450 μ I Buffer B和50 μ I Buffer C，混匀后37°C水浴lh，加入65 μ I Buffer D和65 μ I Buffer E，混匀后37°C水浴2h。加 入 100 μ I Buffer F 和 50Buffer G 溶液，65-80°C水浴 10_20min。
[0030] (3)DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600 μ I Buffer