专利名称：：一种用磁珠分离基因组dna试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：—种应用磁珠从样品中提取基因组DNA的试剂盒，属于生物
技术领域：
，涉及试剂盒的组成及其应用。
背景技术：
：生命是由基因组决定的。绝大部分基因组，包括所有的细胞生命形式的基因组，都是由DNA组成。因此为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提，DNA的提取也就成为分子生物学实验技术最重要、最基本的操作之一。在真核生物中，95%的基因组DNA存在于细胞核中，5%分布在线粒体和叶绿体等细胞器中。植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。DNA提取的方法通常要满足以下几个条件1)保证DNA结构的完整性；2)纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；3)排除有机溶剂和金属离子的污染；4)蛋白质、多糖、脂类等杂质的含量降到最低程度；5)排除RNA分子的污染；6)提取方法要简便、省时、费用低，尽可能的避免使用危险的化学试剂。基因组DNA提取主要分为三大步，第一是细胞裂解，使细胞质膜和核膜破碎，让基因组DNA和其它核酸分子及其它生物大分子尤其是蛋白质解离而游离出来；第二步是去除与DNA结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子；第三步是基因组DNA的富集，将游离在液相中的核酸选择性分配、沉淀或吸附纯化。目前用于细胞裂解的方式主要有机械作用、化学作用和酶作用。1)机械作用包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适于高分子量长链核酸的分离。2)化学作用在一定的PH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX2100、Tween20、NP240、CTAB、sar2cosyl、Chelex2100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。目前基因组DNA提取试剂盒主要用CTAB法、SDS法和异硫氰酸胍裂解。3)酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。基因组DNA的分离与纯化的常规方法主要有1)酚抽提/沉淀法将细胞裂解后，多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的，加入RNA酶除去核酸中的RNA，然后加入异丙醇或乙醇等沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀，除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子，最后用TE溶解DNA备用。2)密度梯度离心法双链DNA、单链DNA、RNA与蛋白质具有不同的密度，因而可以通过密度离心形成不同密度的纯样品区带，该方法适用大量核酸样本的制备。3)层析法层析法是利用不同物质一些理化性质的差异而建立起来的分离分析方法，包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法。在一定的条件下，核酸可以被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其它生物分子分离，结合到固相载体的核酸可以用低盐缓冲液或水洗脱下来。磁珠是指那些直径在几十纳米到数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或无机/无机材料组成的外形多呈现为球状的复合粒子，用于生物分离的磁珠表面修饰活性功能基团。磁珠法提取基因组DNA是近几年才发展起来的核酸提取方法。其提取方法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的基因组DNA纯度高、产量高。提取步骤简单省时，不需要离心，不仅可以满足从小量到大量不同提取规模的要求，还能够选择手动或者自动化操作，使分离技术取得了巨大的进步。在磁珠合成过程中，通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有-C00H，-NH2，-OH，-COH，-SH，_S03等，利用磁珠表面的这些功能基团和具有生物活性分子，如单克隆抗体，链霉亲和素，凝集素、酶以及寡聚核苷酸等，以共价键的形式偶联在磁珠的表面，制备成带有磁性的亲和吸附剂。然后将这些具有磁性的亲和吸附剂与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，可以在磁场作用下从液相中沉降下来，经过简单的洗涤，从而分离得到表面结合有目标分子的磁珠复合物，通过改变洗涤条件可以将目标分子从磁珠上洗脱下来。目前用于基因组DNA提取磁珠的种类根据壳层分子的功能基团而分为以下几种1)表面修饰-C00H的磁珠。2)表面修饰_NH2的磁珠。3)表面修饰Si02的磁珠。4)表面修饰亲和分子的磁珠。5)表面未做修饰的裸Fe304纳米粒子。目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用特异性膜与DNA结合达到分离、回收的目的。著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma，Promega、Invitrogen、TaKaRa、Whatman等，它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒，这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效，DNA质量较高，但价格昂贵。因此市场上需要开发一些操作简单、成本低、提取的DNA质量好、产量高的基因组DNA提取试剂盒。
发明内容本发明的目的在于提供一种基因组DNA提取试剂盒，该试剂盒制备过程简单，成本低，易于质量控制，产品质量稳定，可用于各种样品基因组DNA提取。包括1)具有磁力并可分离磁珠的磁架。2)表面修饰配基的磁珠。3)用于提取基因组DNA的试剂。4)试剂盒说明书。本发明的另一目的在于提供一种磁珠制备方法。包括1)制备直径lOnm-10iim的磁球通过共沉淀的方法合成均一、超顺磁性、单发散性的磁珠。2)磁球包被配基本发明的另一目的在于提供一种应用磁珠提取基因组DNA的方法。包括以下步骤1)样品研磨和细胞裂解将样品在液氮中充分研磨，将研磨好的样品加入离心管中，再加入细胞裂解液裂解细胞，以释放核酸。2)基因组DNA吸附向溶液中加入修饰的磁珠，并加入结合液，基因组DNA被磁珠表面吸附。RNA、蛋白质、多糖及脂类等物质则不被吸附。将离心管置于磁架上，磁珠将完全吸附在离心管壁。3)去除杂质加入漂洗液，对表面吸附有核酸并附着于离心管壁的磁珠进行洗涤，将磁珠表面的杂质洗去。4)基因DNA洗脱回收吸附在磁珠表面的基因组DNA可以直接作为PCR反应的模板，即直接把含有磁珠的液体加到PCR反应液中。也可以加入洗脱液或者ddH20，使吸附在磁珠表面的基因组DNA分子解吸，进入洗脱液中，用于后续的其它分子生物学实验。所述磁架带有磁场，是用于采用磁珠分离基因组DNA吸附磁珠。所述制备磁球的材料一般用硫酸铁铵((NH4)Fe(S04)2)和七水合硫酸亚铁((NH山Fe(S0山)，其中Fe2+和Fe3+的浓度比为1:2-1:4，优选1:2。制备磁球时，通氨水的时间20-40分钟，优选30分钟，温度保持在40-60度，优选50度。所述磁球表面修饰Si02。以硅酸钠为修饰材料，其中1克磁球需要硅酸钠5-13克，优选10克。所述组织包括动物、植物、细菌、真菌、血液、病毒、法医学样品等。所述细胞裂解液为含表面活性剂的溶液，优选含0.1-10%SDS、TritonX_100、Tween20、NP240、1_2%CTAB等。根据实验者材料不同，本发明配制了几种不同的细胞裂解液供实验者选择。所述结合液为一种盐溶液。所述漂洗液是两种，一种是去蛋白的溶液，一种是去杂质的溶液，都含有40%-70%乙醇。所述洗脱液为10mmol/LTris-Cl禾PlmMEDTA，pH8.0的溶液。所述提取的基因组DNA用于后续的实验包括PCR扩增、基因克隆、基因组文库构建、测序、分子杂交和分子标记等。本发明运用硫酸铁铵((NH4)Fe(S04)2)和七水合硫酸亚铁((NH4)2Fe(S04)2)，通过共沉淀的方法合成的磁珠，通过表面修饰可以引入不同的活性基团。因为引入了不同的活性基团，磁珠可以应用于细胞和微生物的分离和鉴定、蛋白质纯化、核酸富集等。本发明修饰了Si02的磁珠可以把基因组DNA吸附在表面，蛋白质、多糖及脂类等其它杂质不被吸附。用漂洗液将其它杂质冲洗掉，吸附在磁珠表面的基因组DNA可以直接作为PCR反应的模板，也可以加入洗脱液或ddH20，将吸附在磁珠表面的基因组DNA洗脱并用于后续实验。本发明的优点为实验者提供了一种基因组DNA快速提取试剂盒。本试剂盒可以贮存在4度，也可以在室温放置，便于运输。运用此试剂盒提供的试剂和方法提取的基因组DNA，产量高，纯度高，不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，安全性好，操作简单、快速，省时，同时可以提取多个样品，易于实现自动化。本发明含有几种裂解液供实验者选择，可以从多种材料中分离基因组DNA，包括动物、植物、细菌、真菌、血液、病毒、动物源饲料、法医学样品等。所获得的基因组DNA可以用于PCR扩增、基因克隆、基因组文库构建、测序、分子杂交和分子标记等后续实验。图1为本发明的磁珠显微图。图2(a)为磁架。1为底座，2为离心管孔，3为磁场区。图2(b)为磁架。4为固定装置。图3为杨树叶片基因组DNA电泳图，1_10为基因组DNA，M为Marker。图4为杨树叶片基因组DNA酶切电泳图，1-10为酶切的基因组DNA，M为Marker。图5为小鼠基因组DNA电泳图，1-10为基因组DNA，M为Marker。图6(a)为小鼠13-actin基因荧光定量检测扩增曲线结果。图6(b)为小鼠5htia基因荧光定量检测扩增曲线结果。图6(c)为小鼠e-actin基因荧光定量检测熔解曲线结果。图6(d)为小鼠5htia基因荧光定量检测熔解曲线结果。图7为不同磁珠试剂盒提取烟草叶片基因组DNA电泳图。1和2为国内某磁珠试剂盒提取的基因组DNA;3和4为国外某磁珠试剂盒提取的基因组DNA;5和6为本发明试剂盒提取的基因组DNA;M为Marker。图8为不同磁珠试剂盒提取小鼠肌肉组织基因组DNA电泳图。1和2为国内某磁珠试剂盒提取的基因组DNA;3和4为国外某磁珠试剂盒提取的基因组DNA;5和6为本发明试剂盒提取的基因组DNA;M为Marker。具体实施例方式实施例1:用磁珠分离基因组DNA试剂盒制备本实施例包括以下步骤1)磁球的制备以硫酸铁铵和硫酸亚铁铵为材料合成均一、超顺磁、单发散性多聚磁球。9.6g硫酸铁铵，3.0g硫酸亚铁铵分别溶解于25ml水和lml浓盐酸中。将上述溶液装入三口烧瓶，通氮气，1000rpm搅伴，并滴加26ml浓氨水，滴加时间大约30min，持续通氮，搅拌约一小时停止搅拌，反应完毕，水洗几次去掉微小颗粒。这个过程三口烧瓶温度保持在50度左右。2)磁球修饰配基取一定量的磁流体于三口烧瓶中。按一定比例称取硅酸钠，溶解于约100mlddH20，并加入lml浓氨水，转速约550rpm，开始滴加硅酸钠溶液，一个小时左右滴加完毕，然后向溶液中滴加0.5M盐酸调pH到6，滴加时间约为30min，继续搅拌一会，反应完毕，用水洗去小颗粒。磁珠悬浮在中性溶液或dc^O里(参见图1)。3)磁架的设计及制造，磁架是用AUTOCAD软件设计并由专门的工厂生产(参见图2)。4)配制用于基因组DNA提取的试剂，包括裂解液(100mMTris-C1，1.4MNaCl，50mMEDTA，2%CTAB(动物和细菌等为10%SDS)pH8.0)，结合液(3MNaAcpH5.2)，洗液A(100mMTris-Cl，0.5MNaCl，lmMEDTA.pH8.040%乙醇)，漂洗液B(25mMTris-Cl(8.0)，1MNaClpH8.070%乙醇)，洗脱液(1Ommol/LTris-Cl和lmMEDTA，pH8.0)。5)分装，根据提取基因组的数量需要磁珠和试剂的量和提取的材料来分装磁珠和试剂。6)每个试剂盒附说明书一份。由图1可以看出，包被了Si02磁珠微粒细小、均匀。图2为磁架，设计合理，使用方便，可以固定在其它设备上使用。另外本发明提供包含磁架的试剂盒和不包含磁架的试剂盒供实验者选择，以节省实验者的费用。实施例2:应用本试剂盒分离杨树叶片基因组DNA及DNA酶切检测利用实施例1所述试剂盒分离杨树叶片基因组DNA并进行酶切实验检测。本实例包括以下步骤1)基因组DNA提取①取50mg植物组织，液氮研磨。②加入450y1细胞裂解液，65。C水浴30min。③加入300y1结合液，温和混匀，12000rpm离心去沉淀。加入50y1磁珠，温和混匀，保持磁珠悬浮5min。⑤将离心管置于磁架上，去除液体。⑥加入800iU洗液A，温和混匀，将离心管置于磁架上，去除液体。⑦加入800iU洗液A，温和混匀，将离心管置于磁架上，去除液体。⑧室温晾干约10min。⑨加入100iU洗脱液，温和混匀，保持磁珠悬浮5min。把离心管置于磁架上，静置2min，小心将液体吸入一新的离心管中，此即为所提取的基因组DNA。⑩利用琼脂糖凝胶电泳对所提基因组DNA进行检测(参见图3)。2)酶切取上述杨树叶基因组DNA用限制性内切酶Pstl和Msel进行酶切，限制性酶切体系如下基因组DNA4iUlOXReactionbuffer2.5u1Pstl1u1MseI1U110XBSA2ill水9.5U1总体积20ill混匀，37度酶切3小时，用琼脂糖凝胶电泳对所切基因组DNA检测(参见图4)。由图3和图4所示，运用本发明的试剂盒分离植物基因组DNA，浓度大，纯度高，双酶切3小时后，DNA带型弥散，说明酶切非常完全，实验重复性好，保证了后续实验的成功性和稳定性。实施例3利用本试剂盒分离小鼠肌肉组织DNA并进行荧光定量PCR检测利用实施例1所述试剂盒分离小鼠肌肉组织基因组DNA并进行荧光定量PCR实验检测。本实例包括以下步骤1)基因组DNA提取①取50mg小鼠肌肉组织，液氮研磨。②加入450y1细胞裂解液，10ii1蛋白酶K(20mg/ml)，10ii1RNaseA，58。C水浴30min。③加入300ii1结合液，温和混匀，12000rpm离心去沉淀。加入50y1磁珠，温和混匀，保持磁珠悬浮5min。⑤将离心管置于磁架上，去除液体。加入800iU洗液A，温和混匀，将离心管置于磁架上，去除液体。⑦加入800iil洗液A，温和混匀，将离心管置于磁架上，去除液体。⑧室温晾干约10min。⑨加入100iil洗脱液，温和混匀，保持磁珠悬浮5min。放入磁架，静置2min，小心将液体吸入一新的离心管中，此即为所提取的基因组DNA。⑩琼脂糖凝胶电泳对所提基因组DNA进行检测(参见图5)。2)荧光定量检测取上述小鼠肌肉组织基因组DNA，用ABI公司的7700PCR仪对小鼠5htia基因进行荧光定量检测，利用小鼠P-actin基因作为校正。结果如表l。引物P-actin引物序列P-actinF5'ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3'P-actinR5，CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3'5htia引物序列5-HTIAF:5'AACAAGTGGACTCTGGGTC3'5-HTIAR:5'TGGAGATGAGAAAGCCAATG3'PCR扩增体系因为DNA浓度较高，分别把上述基因组DNA稀释20倍，取1做作为PCR扩增模板。ddH2017.5illTaqPCRBuffer2ii1d證Mixture2ii1Taq0.5U1PrimerF1li1PrimerRlulDNA1ii1Total25u1PCR扩增条件P-actin扩增条件i.94。C预变性2minii.94。C变性30seciii.63。C退火30seciv.72。C延伸30sec35循环5htia扩增条件退火温度为57。C，其它条件同上。表1小鼠5htia基因和P-actin基因扩增CT值和浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由图5所示，运用本发明的试剂盒分离动物基因组DNA，浓度和纯度高。由图6(a)、(b)、(c)、和(d)可以看出，运用本发明试剂盒提取的基因组DNA进行荧光定量PCR检测，13-actin扩增范围非常稳定，5htia基因扩增有一定的规律，其扩增曲线和熔解曲线图非常漂亮，熔解曲线呈现单峰，扩增特异，说明DNA纯度高。运用本试剂盒可以同时提取多个样品的基因组DNA，实验重复性好，即使是不同的人不同的时间操做，也能得到一致的结果，从而保证了后续实验的成功性和稳定性，避免了人工操做引起的差异和错误。实施例4本发明的试剂盒与市场上已有的磁珠法基因组DNA提取试剂盒分离动物和植物基因组DNA的比较。利用实施例1所述试剂盒，根据实施例2和实施例3所述方法，与市场上已有磁珠法分离基因组DNA试剂盒分别进行了动物(小鼠肌肉)和植物(烟草叶片)基因组DNA提取比较实验，所用对比试剂盒分别为国外某磁珠提取DNA试剂盒，国内某磁珠提取基因组DNA试剂盒，每个实验两个重复。所提取的基因组DNA进行了紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测(参见图7，图8)。紫外分光光度检测如表2和表3:表2植物基因组DNA紫外分光光度检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3动物基因组DNA紫外分光光度检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由图7、图8和表2表3可以看出，本发明提取基因组DNA与国外某磁珠试剂盒提取的基因组DNA浓度和得率及纯度没有明显区别，在得率和浓度上都比国内某磁珠试剂盒提取的基因组DNA高。但是本发明成本低，在价格上要比国外的磁珠试剂盒便宜许多。权利要求一种用磁珠分离基因组DNA试剂盒及其应用，其技术体系包括(1)磁球的制备；(2)磁球配基修饰；(3)磁架的设计及制造；(4)基因组DNA提取试剂；(5)基因组DNA提取的方法。2.根据权利要求1所述，其特征在于，它是一种用磁珠分离基因组DNA的试剂盒。3.根据权利要求l所述，其特征在于，用硫酸铁铵((NH4)Fe(S04)2)利七水合硫酸亚铁((NH4)2Fe(S04)2)为磁性材料，通过共沉淀的方法来合成磁球。其中，硫酸铁铵和七水合硫酸亚铁的用量分别为9.6克和3.0克，合成过程中温度保持在50度，通氨水的时间是30分钟，其间要通氮气，并且以1000rpm转速搅伴。反应一小时后，磁球就合成了。合成的磁球可以修饰不同的配基，作为吸附和结合相应分子的载体。4.根据权利要求1或权利要求3所述，其特征在于，磁球修饰配基，以硅酸钠为材料修饰配基为SiOy用于吸附基因组DNA。5.根据权利要求1所述，其特征在于，配有磁架，其作用为吸附磁珠。6.根据权利要求1所述，其特征在于，基因组DNA提取试剂，包括裂解液(lOOmMTris-C1，1.4MNaCl，50mMEDTA，2%CTAB(动物、细菌等为10%SDS)pH8.0)，结合液(3MNaAcpH5.2)，洗液A(lOOmMTris-Cl，O.5MNaCl，lmMEDTA.pH8.040%乙醇)，洗液B(25mMTris-Cl(8.0)，腦aClpH8.070%乙醇)，洗脱液(1Ommol/LTris-Cl和lmMEDTA，pH8.0)。所述试剂根据材料不同，裂解液不同。7.根据权利要求1所述，其特征在于，基因组DNA提取的方法。所用方法根据材料不同，方法稍有调整，主要步骤包括细胞裂解、核酸吸附、杂质去除和核酸洗脱。8.根据权利要求1或权利要求2所述用磁珠分离基因组DNA试剂盒，其特征在于可以从动物、植物、细菌、真菌、血液、病毒、动物源饲料、法医学样品等分离基因组DNA，所获得的基因组DNA可以用于PCR扩增、基因克隆、基因组文库构建、测序、分子杂交和分子标记等实验。全文摘要本发明提供了一种用磁珠分离基因DNA试剂盒及其应用。试剂盒包括磁珠、磁架、基因组DNA提取试剂(裂解液、结合液、漂洗液A和漂洗液B和洗脱液)及说明书，基因组DNA提取主要步骤包括细胞裂解、核酸吸附、杂质去除和核酸洗脱。应用本试剂盒提取基因组DNA不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，安全性好，操作简单、快速，省时，同时可以提取多个样品。本试剂盒可以从动物、植物、细菌、真菌、血液、病毒、动物源饲料、法医学样品等材料中提取基因组DNA，DNA得率高，纯度高，所获得的基因组DNA可以用于PCR扩增、基因克隆、基因组文库构建、测序、分子杂交和分子标记等实验。本试剂盒可以贮存在4度，也可以在室温放置，便于运输。文档编号C12N15/10GK101792757SQ20101013596公开日2010年8月4日申请日期2010年3月30日优先权日2010年3月30日发明者周卫东申请人:上海鼎国生物技术有限公司