提取乳酸菌基因组dna的试剂盒及相应的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法，试剂盒包括Buffer-1～Buffer-6，以及其它试剂，组成简单，成本低；其提取方法操作简单、方便，成本低，适用于乳酸菌多样性分析时，大量常规样品的乳酸菌基因组DNA的提取。本发明适用于乳酸菌基因组DNA的提取。
【专利说明】提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种DNA的提取试剂盒及相应的提取方法，具体涉及一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法。
【背景技术】[0002]乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同且能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，并积累了丰富的经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。
[0003]随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，并已成功介入到益生菌的鉴定领域。由于乳酸菌的细胞壁厚，肽聚糖含量较高，交联程度大，细胞裂解困难等问题，因此提供一种高效的提取乳酸菌基因组DNA的方法及其试剂盒具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题，是提供一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法，试剂盒包括Buffer-1~Buffer-6，以及其它试剂，组成简单，成本低；其相应的提取方法操作简单、方便，成本低，适用于乳酸菌多样性分析时，大量常规样品的乳酸菌基因组DNA提取。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:
一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒，它包括以下试剂:
Buffer-1为质量百分比为10%的十二烷基硫酸钠溶液；
Buffer-2为150~200mg/mL的溶菌酶,用无菌水配制；
Buffer-3 为 15 ~20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值为 7.5 ；Buffer-4 为 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再缓慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 为 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 为 IOmM Tris-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ；
其它试剂:体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合的抽提液；
异丙醇；
体积百分比为70%的乙醇。
[0006]本发明还提供了相应的提取乳酸菌基因组DNA的方法，它按照以下步骤顺序进行:
(O取对数生长期的乳酸菌菌液3mL,于12000rpm离心Imin收集菌体，菌体用Buffer-6洗涤两次，后用500 μ L Buffer-6重悬菌体，得菌体悬浊液I ;
(2)将菌体悬浊液I中加入50μL Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，温箱温育lh，裂解细胞壁，得菌体悬浊液2 ；
(3)将菌体悬浊液2中加入10μ L Buffer-3,混匀后于55°C温箱过夜消化，使蛋白变质或降解，得菌体悬浊液3;
(4)将菌体悬浊液3中加入IOOyLBuffer_4和IOOyL Buffer-5溶液，混匀，65°C水浴加热15min,沉淀蛋白，得菌体悬池液4 ；
(5 )用等体积的抽提液将菌体悬浊液4抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等体积的抽提液将上清液5抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液,得上清液6 ；
(6)将上清液6用0.8倍体积的异丙醇沉淀基因组DNA，得沉淀7 ；
(7)沉淀7用70%乙醇洗涤沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最终得乳酸菌基因组DNA溶液。
[0007]由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于: 针对乳酸菌细胞壁厚、肽聚糖含量高、交联程度大以及细胞裂解困难的问题，本发明
提供了一种高效稳定提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法，操作简单、方便，成本低，适用于乳酸菌多样性分析时，大量常规样品的乳酸菌基因组DNA提取，提取浓度高，所提取的DNA浓度90~373ng/ μ L，DNA纯度较好，其0D26(l/0D28(l值在标准范围1.70-1.90之间。
[0008]本发明适用于提取乳酸 菌基因组DNA。
[0009]本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例7的DNA电泳图；其中，泳道I为本发明实例I提取的乳酸菌DNA ;泳道2为本发明实施例6提取的乳酸菌DNA ;泳道3为23130bp DNA Maker。
[0011]图2为本发明实施例8的16s rDNA PCR扩增图；其中，泳道I为2000bp DNAMaker ;泳道2为实例I提取的乳酸菌DNA ;泳道3为实施例6提取的乳酸菌DNA。
[0012]图3为本发明实例9的DNA电泳图；其中，泳道I为23130bp DNA Maker ;泳道2-5为提取君乐宝乳业公司保存的乳酸菌菌种的DNA，编号分别为乳酸乳球菌103、干酪乳杆菌Wl 18、植物乳杆菌3301、粪肠球菌1-1。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]实施例1 一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒及相应的提取方法 一种提取乳酸菌基因组DNA的方法，它按照以下步骤顺序进行:
(O取对数生长期的乳酸菌体液3mL，于12000rpm离心Imin收集菌体，菌体用Buffer-6洗涤两次，后用500 μ L Buffer-6重悬菌体，得菌体悬浊液I ;
(2)将菌体悬浊液I中加入50μ L Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，温箱温育lh，裂解细胞壁，得菌体悬浊液2 ；(3)将菌体悬浊液2中加入10μ L Buffer-3,混匀后于55°C温箱过夜消化，使蛋白变质或降解，得菌体悬浊液3;
(4)将菌体悬浊液3中加入IOOyLBuffer_4和IOOyL Buffer-5溶液，混匀，65°C水浴加热15min,沉淀蛋白，得菌体悬池液4 ；
(5 )用等体积的抽提液将菌体悬浊液4抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等体积的抽提液将上清液5抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液,得上清液6 ；
(6)将上清液6用0.8倍体积的异丙醇沉淀基因组DNA，得沉淀7 ；
(7)沉淀7用70%乙醇洗涤沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最终得乳酸菌基因组DNA溶液，DNA浓度为295ng/ μ L，OD260/OD280值为1.83。
[0015]其中，提取乳酸菌基因组DNA使用的试剂盒包括以下试剂:
Buffer-1为质量百分比为10%的十二烷基硫酸钠溶液；
Buffer-2为200mg/mL的溶菌酶,用无菌水配制；
Buffer-3 为 20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值为 7.5 ；Buffer-4 为 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再缓慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 为 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 为 IOmM Tri s-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ；
其它试剂:体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合的抽提液；
异丙醇；
体积百分比为70%的乙醇。
[0016]实施例2-5 提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒
实施例2-5分别为一种提取乳酸菌基因组DNA使用的试剂盒，本实施例将它们用于按照实施例1的提取方法提取乳酸菌基因组DNA。这些试剂盒与实施例1所涉及的试剂盒的不同之处仅在于Buffer-2和Buffer-3的浓度不同，具体如下表所示:
【权利要求】
1.一种提取乳酸菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于它包括以下试剂: Buffer-1为质量百分比为10%的十二烷基硫酸钠溶液； Buffer-2为150~200mg/mL的溶菌酶,用无菌水配制；
Buffer-3 为 15 ~20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值为 7.5 ；Buffer-4 为 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再缓慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 为 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 为 IOmM Tris-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ； 其它试剂:体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合的抽提液； 异丙醇； 体积百分比为70%的乙醇。
2.一种提取乳酸菌基因组DNA的方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行: (O取对数生长期的乳酸菌菌液3mL,于12000rpm离心Imin收集菌体，菌体用Buffer-6洗涤两次，后用500 μ L Buffer-6重悬菌体，得菌体悬浊液I ;
(2)将菌体悬浊液I中加入50μL Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，温箱温育lh，裂解细胞壁，得菌体悬浊液2 ； (3)将菌体悬浊液2中加入10μ L Buffer-3,混匀后于55°C温箱过夜消化，使蛋白变质或降解，得菌体悬浊液3; (4)将菌体悬浊液3中加入100μ L Buffer-4和100 μ L Buffer-5溶液，混匀，65°C水浴加热15min,沉淀蛋白，得菌体悬池液4 ； (5 )用等体积的抽提液将菌体悬浊液4抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等体积的抽提液将上清液5抽提基因组DNA，除去蛋白，12000rpm离心IOmin,取上清液,得上清液6 ； (6)将上清液6用0.8倍体积的异丙醇沉淀基因组DNA，得沉淀7 ； (7)沉淀7用70%乙醇洗涤沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最终得乳酸菌基因组DNA溶液。
【文档编号】C12N15/10GK103509788SQ201310502121
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】王世杰, 薛玉玲, 朱宏 申请人:石家庄君乐宝乳业有限公司