Her2基因扩增的检测引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及HER2基因扩增的检测引物组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性肿瘤中发病率较高的癌症之一。因乳腺癌初期病症不明显，确诊时 往往已是恶性，严重危害妇女生命。2002年全球乳腺癌发病达到120万，到2010年，这个数 据超过了 160万。同时，2010年乳腺癌导致了 42. 5万例女性死亡。中国是乳腺癌发病率增 长最快的国家之一，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年 3%的速度递增，成为城市中死亡率增长最快的癌症，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。中国 女性乳腺癌的发病年龄从三十岁开始增加，而且发病后就诊相对较晚，约有百分之三十五 的患者就诊时已经是中晚期。在我国妇女中，乳腺癌的发病率和死亡率均呈逐年上升势头， 中国主要城市10年来乳腺癌发病率增长了 37%，死亡率增长了 38. 9%，农村死亡率增长了 39.7%。在北京、上海、天津等大城市，乳腺癌已占据妇女恶性肿瘤发病的首位。数据显示， 几个大城市的乳腺癌发病率已从1979年的每十万人口里有19人上升到2010年的每十万 人口里有50~60人。
[0003] 寻找有效的治疗手段一直是肿瘤学界研究的方向。现在已知，大约25~30%的乳腺 癌有HER2基因扩增。此外，不同比例的卵巢癌，前列腺癌，胃癌及肺癌也可能有HER2过度表 达的现象存在。正确检测和评定乳腺癌的J1ER2基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后 判断至关重要。赫赛汀（Here印tin)于1998年首次获批，它作为一种免疫治疗药物，能特异 性地抑制具有HER2癌基因扩增的癌细胞的生长，使病人预后大大改善。2012年6月8日， 新的乳腺癌药物Perjeta获得FDA的批准，在临床试验中，与现有标准护理相比，Perjeta使 癌症的恶化推迟了额外6个月。但与Herceptin相同，此药物也仅适用于HER2扩增阳性的 乳腺癌患者。因此可知，癌细胞HER2基因扩增是决定Herceptin和Perjeta是否有效的关 键性指标。
[0004] 现阶段国内外一般采用免疫组织化学（IHC)法检测HER2受体蛋白表达状态和荧 光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH)法检测HER2基因扩增水平。其 中IHC检测结果只能作为前期初步筛查使用，IHC检测具有成本低、技术简单、便于操作等 特点，常是临床检测的首选。但IHC容易受到组织影响，缺乏标准化，结果判断存在主观差 异，造成不同实验室之间的IHC检测结果可能存在差异。HER2的FISH检测具有较高的准确 性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性较高，目前是检测J1ER2基因扩增的"金 指标"。但是FISH存在仪器价格昂贵、检测周期长、患者收费高、检测者专业知识和实验室 条件的限制，检测试剂一直被国内或国外1、2个厂家所垄断，只能在具有资质的大医院进 行，造成大量人员不能得到及时的诊断而失去个体化用药的机会，因此急需一种高灵敏度、 准确度、易于操作标准化、多样化检测等优势检测方法。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供一种常规的、适合大众医院的HER2 基因扩增检测产品，具体为一组HER2基因扩增的检测引物组，可以实现快速准确的检测， 适合制备成检测试剂大规模临床使用。
[0007] 本发明的另一目的是提供包括该HER2基因扩增的检测引物组的试剂盒。
[0008] 该HER2基因扩增的检测引物组，其特征在于，包括HER2引物组和GAPDH内参引物 组，其中 HER2引物组包括： 上游引物HER2(R)_F:如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列， 下游引物册1?2〇?)-1?:如3￡〇10勵:2所示的核苷酸序列， Taqman荧光探针HER2(R)-FP:如SEQIDN0:3所示的核苷酸序列在5'端标记荧光报 告基团，除5'端标记荧光淬灭基团； GAPDH内参引物组： 上游引物GAPDH-F:如SEQIDN0:4所示的核苷酸序列， 下游引物64?011-1?:如3￡〇10勵:5所示的核苷酸序列， Taqman荧光探针GAPDH-FP:如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列在5'端标记荧光报告 基团，除5'端标记荧光淬灭基团。
[0009] 上述引物组中，Taqman荧光探针的荧光淬灭基团优选标记在探针核苷酸序列的 3'端。
[0010] 本发明针对HER2转录组受体结构域设计特异性引物，选择GAPDH为内参对照。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分 别标记一个报告荧光报告基团和一个淬灭荧光报告基团。探针完整时，报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧 光报告基团和淬灭荧光报告基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一 条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0011] 作为优选方案，上述HER2基因扩增的检测引物组中，荧光报告基 团为6-羧基焚光素（6-carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基焚光素 (Hexachlor〇-6_methylfluorescein，HEX)、VIC焚光染料、四氣 _6_ 駿基焚光素（tetrachl oro-6-carboxyfluorescein，TET)、駿基-X-罗丹明（Carboxy-x-rhodamine，R0X)、6_ 駿基 四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、横酰罗丹明（Sulforhodamine 101，TexasRed)、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯（6-Carb oxy-f，5' -dichloro_2,，7' -dimethoxyfluorescein，JOE)、花菁 3 (cyanine3,Cy3)、花菁 3.5(〇5^11；[1163.5，073.5)、花菁5(05^11；[1165，075)和花菁5.5(05^11；[1165.5，075.5)中的 至少一种；荧光淬灭基团为6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑 洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2和黑洞淬灭剂3中的至少一种。以上荧光报告基团和荧光淬灭基 团均为现有市售商品。
[0012] 其中黑洞淬灭剂 1(BlackHoleQuencher1，BHQ1)、黑洞淬灭剂 2(BlackHole Quencher2，BHQ2)、黑洞淬灭剂 3(BlackHoleQuencher3，BHQ3)、4_(4_ 二甲基氨基苯偶 氮基）苯甲酸（4_(4'-(1;[11161:1171&111；[110口1161171&20)&61120;[0&(^(1，0厶130￥1)为生物搜索技术 公司（Biosearch Technologies, Inc)的产品。
[0013] 优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4_二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸时，荧光报告基 团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧 光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种。
[0014] 当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、 四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六 氯-6-甲基荧光素中的至少一种。
[0015] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四 氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六 氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种。
[0016] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、 花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种。
[0017] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的 一种。
[0018] 焚光报告基团和焚光淬灭基团的搭配参见下表：
最优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1。
[0019] 本发明提供的HER2基因扩增检测试剂盒，包括以上所述的HER2基因扩增的检测 引物组。
[0020] 作为优选方案，上述HER2基因扩增检测试剂盒中，还包括HER2/GAPDH定量标准品 和阴性质控品，该标准品为插入了J1ER2和GAPDH基因片段的重组质粒，阴性质控品为H20。
[0021] 作为优选方案，上述HER2基因扩增检测试剂盒中，重组质粒的载体质粒为T载体， 标准品设5\104拷贝/11^、5\105拷贝/11^、5\10 6拷贝/11^和5\107拷贝/11^四个