梯度浓 度。
[0022] 增加标准品可以实现定量检测HER2基因扩增程度，更有利于增加检测准确性。通 过定量标准品获得标准曲线可以对J1ER2基因和内参基因GAPDH进行精确定值。阴性质控 品主要用于判断检测过程中是否存在污染情况。
[0023] 作为优选方案，以上任一所述HER2基因扩增检测试剂盒中，还包括含Mg2+、DNA聚 合酶及dNTPs的PCR反应缓冲液。可以根据需要自行配制或者直接购买市售商品，例如 TAKARA公司的PCR缓冲液。
[0024] 作为优选方案，上述HER2基因扩增检测试剂盒，试剂分为HER2/GAPDH定量标准 品、阴性质控品、以及J1ER2反应体系和GAPDH反应体系共四个独立包装的体系，其中 HER2反应体系：10XPCR反应缓冲液2. 5yL，浓度10yM的HER2(R)-F0. 5yL，浓度 10yM的HER2 (R)-R0. 25yL，浓度10yM的HER2 (R)-FP0. 5yL，无菌超纯水将反应体系 补至 19.8yL; GAPDH反应体系：10XPCR反应缓冲液2. 5yL，浓度10yM的GAPDH-F0. 5yL，浓度 10yM的GAPDH-R0. 25yL，浓度10yM的GAPDH-FP0. 5yL，无菌超纯水将反应体系补至 19. 8yL〇
[0025] 本发明还提供以上任一所述的HER2基因扩增检测试剂盒的使用方法，是将待检 样品抽提DNA后，分别使用HER2引物组和GAPDH内参引物组进行荧光定量PCR扩增，如果 检测通道没有出现S形扩增曲线，判断为HER2和GAPDH扩增阴性；如果检测通道出现S形 扩增曲线，参照以下三种标准判断： (1) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度至少一项小于1X103拷贝/mL，则检测 结果无效，应重新提取样本核酸进行检测； (2) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度均在1X103拷贝/mL~lX10s拷贝/mL之间，直接进行以下计算： M=HER2基因检测浓度/GAPDH内参基因检测浓度， 当M彡0. 2时，则结果判读为：无HER2基因扩增， 当M>0. 2时，则结果判读为：HER2基因扩增； (3) 如果HER2基因和GAPDH内参基因检测浓度至少一项大于1X10s拷贝/mL，则需要 将待检样品稀释至线性范围后重新测定，并根据（2)的标准判断结果。
[0026] 作为优选方案，上述HER2基因扩增检测试剂盒的使用方法中，荧光定量PCR扩增 程序为：45~55°C20 分钟；92~95°C3~5 分钟；92~95°C10~15 秒；55~65°C，10~35 秒，40 个 循环。优选为：50°C，20分钟；94°C，4分钟；94°C，15秒；60°C，35秒，40个循环。
[0027] 本发明与现有技术相比具有以下有益效果： 利用本发明的检测引物组和试剂盒可以快速、简便地检测乳腺癌患者中J1ER2基因是 否发生扩增，相比目前乳腺癌HER2检测金标准FISH法，具有检测灵敏度高、时间短、一般 1. 5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、假阳性少，适合于大规模临床开展。从而实现 对HER2基因扩增快速、有效且准确的检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
[0028] 本发明的检测引物通过荧光定量PCR扩增，由定量标准品标准曲线对HER2基因和 内参基因GAPDH进行精确定值，然后计算HER2基因和内参基因GAPDH拷贝数比值，从而确 定是否存在J1ER2基因扩增。HER2基因扩增是决定乳腺癌患者是否采用赫赛汀和帕妥珠单 抗治疗有效性关键性指标。因此临床标本检测中是否存在HER2基因扩增，可为临床医生选 择靶向药物提供参考，降低治疗风险以及负担。
【附图说明】
[0029] 图1是实施例1中采用荧光定量PCR仪检测8例乳腺癌患者石蜡标本得到的扩增 曲线。
[0030] 图2是实施例2中采用荧光定量PCR仪检测梯度浓度HER2/GAPDH定量标准品得 到的曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明 所采用的试剂均为市售。
[0032] 实施例1 1.引物与探针的设计 针对HER2转录组受体结构域设计特异性引物HER2 (R) -F和HER2 (R) -R，与Taqman荧 光探针HER2 (R) -FP。Taqman荧光探针HER2 (R) -FP的5'端标记的荧光报告基团是6-羧基 焚光素（6_carboxyfluorescein，FAM)，3'端标记的淬灭基团是黑洞淬灭剂1(BlackHole Quencher1，BHQ1)。
[0033] 其中，HER2 (R)-F:AACACCCACCTCTGCTTCGT(SEQIDNO: 1)， HER2(R)-R：GCCCACACACTCGTCCTCT(SEQIDNO:2), HER2(R)-P：TGCCCTGGGACCAGCTCTTTCG(SEQIDN0:3)〇
[0034] 2?引物与探针的设计 针对GAPDH基因设计特异性引物GAPDH-F和GAPDH-R，与Taqman荧光探针GAPDH-FP。Taqman荧光探针GAPDH-FP的5 '端标记的荧光报告基团是6-羧基荧光 素（6-〇31~13(?5^111〇代8〇6；[11，？4]\〇,3'端标记的淬灭基团是黑洞淬灭剂10313〇1<：11〇16 Quencher1，BHQ1)。
[0035] 其中，GAPDH-F:TGCACCACCAACTGCTTAGC(SEQIDN0:4)， GAPDH-R：GGCATGGACTGTGGTCATGAG(SEQIDNO:5), GAPDH-FP：CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTT(SEQIDN0:6)〇
[0036] 3.HER2反应液的配制 将各成分（引物、探针和PCR反应缓冲液）按一定比例混合在一起。单个反应聚合酶链 式反应液包括 10XPCR反应缓冲液 2. 5yL，HER2 (R)-F(浓度 10yM) 0? 5yL，HER2 (R)-R (浓度 10yM) 0.25yL，HER2(R)-FP(浓度 10yM) 0.5yL，dNTP2.0yL，最后用无菌超纯 水将反应体系补至19. 8yL。
[0037] 4.GAPDH反应液的配制 将各成分（引物、探针和反应缓冲液）按一定比例混合在一起。单个反应聚合酶链式反 应液包括10XPCR反应缓冲液2. 5yL，GAPDH-F(浓度10yM) 0? 5yL，GAPDH-R(浓度 10yM) 0.25yL，GAPDH-FP(浓度 10yM) 0.5yL，dNTP2.0yL，最后用无菌超纯水将反应 体系补至19. 8yL。
[0038] 5?检测反应 取HER2反应液19. 8yL和DNA聚合酶0. 2yL( 1个单位)配制成反应体系1，然后加入 5. 0yL待检模板。取GAPDH反应液19. 8yL和DNA聚合酶0. 2yL(1个单位)配制成反应 体系2,然后加入5. 0yL待检模板。每批次反应均设置阴性质控（H20)和HER2/GAPDH病毒 定量标准品I-IV。反应条件：50°C，20分钟；94°C，4分钟；94°C，15秒；60 °C，35秒，40个 循环。
[0039] 采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集 设在60 °C。
[0040] 6?结果判断： HER2和内参基因检测参考值范围均为：1X103拷贝/mL~lX10 8拷贝/mL(包括检测下 限和检测上限），样本检测可能出现以下情况： (1)如果HER2基因或者内参基因检测结果任意一项(或同时）小于1X103拷贝/mL，则 检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测。
[0041] (2)如果HER2和内参基因检测浓度均在1X103拷贝/mL~lX10s拷贝/mL之间， 直接进行以下计算并判读结果。
[0042]M=HER2基因检测浓度/内参基因检测浓度 当M彡0. 2时，则结果判读为：无HER2基因扩增； 当M>0. 2时，则结果判读为：HER2基因扩增。
[0043] (3)如果HER2基因或者内参基因检测结果任意一项（或同时）大于1 X 10s拷贝/ mL，则建议将样本稀释至线性范围后重新测定，根据上面（2)的公式计算并判读结果。
[0044] 利用上述方法对8例乳腺癌患者石蜡标本进行检测，检测结果蓝色为HER2基因， 红色为GAPDH基因，结果显示，其中1、2和4号标本HER2没有扩增，3、5、6、7和8号为HER2 扩增(对应的PCR扩增曲线图片请见附录图1)，该8例乳腺癌患者PCR检测结果和FISH检 测结果一致，证明了该试剂盒和FISH检测技术具有很好的相关性。
[0045]表1
表中带有E的数值为科学计数法表达，表示E前面数值乘以10的n次方，n为" + "后 面的数值。
[0046]实施例2 HER2/GAPDH定量标准品I-IV的构建： (1)扩增HER2和GAP