Fbxw7基因及表达产物在肾癌检测、肾癌药物制备中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体的，本发明涉及FBXW7基因及表达产物在肾癌检 测、肾癌药物制备中的用途，更具体的，本发明涉及一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制 备检测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途、一种检测肾癌的试剂盒、一种FBXW7基因和/或 FBXW7蛋白在制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途、一种抑制 肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的装置以及一种非治疗目的的抑制肾癌细胞增殖 和/或诱导肾癌细胞凋亡的方法。
【背景技术】
[0002] FBXW7 基因（F-box和WD-40 域蛋白 7)又称HCDC4。
[0003] FBXW7作为泛素蛋白酶体降解途径的重要识别因子之一，其作用的很多底物都是 癌基因，如重要的cyclinE，c-Myc，c-Jun和Notch都通过FBXW7介导的泛素蛋白酶体途径 进行降解的。研究显示，FBXW7突变和缺失会导致与癌细胞增殖相关的蛋白累积，如Myc和 Cyclin-E。FBXW7可以通过降解在细胞生长和分化过程中具有重要作用的蛋白质来调节细 胞周期、增殖和分化。
[0004] Sahoko和一些人发现FBXW7是造血系统中一种重要的防御因子，它的缺失会导致 造血细胞难以成熟和急性淋巴性白血病的发生。Takehiko发现P5调节FBXW7的转录，这会 导FBXW7表达障碍和预后不良。Lwatukim表示在结直肠癌组织中FBXW7表达与正常组织相 比明显降低是预后不良的标志。宫颈癌中FBXW7突变导致其与cyclinE中的CDPS关联减 弱，并诱导cyclinE不降解，这种调节缺失会导致细胞周期异常和肿瘤的发生。晚期胶质 细胞瘤中FBXW7的缺失导致有丝分裂的异倍体增加。
[0005] 肿瘤的分级和分期对临床上制定治疗方案和估计预后有参考价值。病理分级是根 据组织分化程度即高、中、低以及未分化相对应的IV、III、II和I级。而肿瘤的分期，?M分 期系统是目前国际上最为通用的肿瘤分期系统。每一种肿瘤的TNM分期系统各不相同，因 此TNM分期中字母和数字的含义在不同肿瘤所代表的意思不同。TNM分期中T，N，M确定后 就可以得出相应的总的分期，即I期，II期，III期，IV期等。有时候也会与字母组合细分 为Ila或Illb等等。I期的肿瘤通常是相对早期的肿瘤有着相对较好的预后。分期越高意 味着肿瘤进展程度越高。
[0006] ?M分期系统中：1，1'("1'"是肿瘤一词英文"1\1111(^"的首字母）指肿瘤原发灶的情 况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1~T4来表示；2，N( "N"是 淋巴结一词英文"Node"的首字母）指区域淋巴结（regionallymphnode)受累情况。淋巴 结未受累时，用N0表示，随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1~N3表示；3,M("M" 是转移一词英文"metastasis"的首字母）指远处转移（通常是血道转移），没有远处转移 者用M0表示，有远处转移者用Ml表示。在此基础上，用IT#三个指标的组合（grouping) 划出特定的分期（stage)。
[0007]目前，未见关于FBXW7在肾癌进展程度中生物学功能的研究报道。
【发明内容】
[0008] 依据本发明的第一方面，本发明提供一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备检 测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途。该用途是基于发明人的以下发现而作出的：FBXW7基 因在肾癌中为抑癌基因，FBXW7高表达的肾癌患者预后远优于FBXW7低表达肾癌患者人群， FBXW7蛋白表达上调与RCC(肾细胞癌）临床病理分级之间具有高度相关性（p= 0. 0094) 以及FBXW7表达上调与肿瘤-淋巴结-转移（TNM)阶段也有很强的相关性（p= 0. 0080)。 FBXW7基因和/或FBXW7蛋白，包括其定性或定量信息能够作为检测肾癌发展的标志物。
[0009] 依据本发明的第二方面，本发明提供一种检测肾癌的试剂盒，其包括检测FBXW7 mRNA和/或FBXW7蛋白的试剂。
[0010] 该试剂盒包括的试剂能够检测定量FBXW7mRNA和/或FBXW7蛋白。根据本发明实 施例，所称试剂包括定量FBXW7mRNA的qPCR引物SEQIDN0 :1和2，以及内参基因引物SEQ IDN0 :3 和 4,，选择的内参基因为GAPDH基因，SEQIDN0 :1-4 分别为AAGGGCAACAACGACG， AGGGAGCAATGAAATGAAGT，CTGGGCTACACTGAGCACC和AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG;和 / 或所称试 剂包括检测FBXW7蛋白的免疫组织化学试剂。所称的qPCR或者qRT-PCR，是通过实时（real time)的方法，测定样品中某个模版的起始量ct值，即循环阈值。由于前面RNA提取、反 转等步骤，各个步骤存在不同的效率，ct值并无法真实反应样品中模版的绝对量，因此，需 要一个内参来做为参考。选择的内参基因应是稳定的，在不同样品中被认为是表达量一致 的，通过测量内参基因，可以在后面分析过程中将不同样品的起始量均一化。选择的内参需 要实在不同样品中有稳定表达量的基因，在该实施例中，经过试验验证，选择GAPDH基因作 为内参，以及利用SEQIDN0:l-4,能够很好的用于相对定量FBXW7mRNA。免疫组织化学， (Immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定 的一项技术，其是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行 定位、定性及定量的研究。
[0011] 根据本发明的实施例，所称试剂盒还包括标签或者说明书，所述标签或者说明书 注有以下内容，以对检测结果进行说明：当所检肾癌患者的FBXW7蛋白为低表达，则提示其 术后的五年生存率低于0. 3的概率远高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群，和/或提 示其处于TW分期的中后期的概率高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群；所称FBXW7 蛋白为高表达或者为低表达是通过对免疫组织化学结果进行评分来判定的，所述免疫组织 化学结果的分值为axb，定义ax 4为低表达，axb>4为高表达，其中，a、b均为整 数，a为切片的染色强度的等级，a的取值范围为0-3,0-3等级依次分别对应的切片的染色 强度为阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性，b为阳性细胞百分比得分，b的取值范围为1-5， 1-5分数依次对应于阳性细胞百分比[1 %，5% ]、（5%，25% ]、（25, 50% ]、（50%，75% ] 和（75%，100%]。在本发明的一个实施例中，该试剂盒进一步包括，切片的苏木精染色强 度阴性对照图和中度阳性对照图，用作a取值时的参考，有利于将FBXW7蛋白的量准确定为 高表达或低表达。
[0012] 利用该试剂盒及其包含的检测结果说明或对照，来检测肾癌患者，能够用以预估 判断或者辅助判断该个体的肾癌的发展阶段、术后肾癌发展情况等，能够用以辅助临床诊 断监测、选择适合的治疗方式。
[0013] 依据本发明的第三方面，本发明提供一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备 抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途。该用途是基于发明人发现 FBXW7基因高表达会抑制肾癌的增殖以及诱导肾癌细胞凋亡而作出的。FBXW7基因能够用 于治疗肾癌的潜在靶点，肾癌药物作用的目标基因。
[0014] 依据本发明的第四方面，本发明提供一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞 凋亡的装置，该装置包括：基因表达调节单元，用以使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上 调，以抑制所述肾癌细胞和/或诱导所述肾癌细胞凋亡。该装置是基于发明人体外试验发 现FBXW7基因高表达能够抑制肾癌的增殖以及诱导肾癌细胞凋亡而作出的，在肾细胞癌转 染FBXW7质粒后，通过CCK8、集落形成和流式细胞仪检测技术，显示肾癌细胞ACHN和A704 细胞系增殖活性降低，细胞凋亡增加；而通过Westernblot分析，FBXW7高表达的肾癌细胞 与阴性对照组细胞相比，其细胞增殖活化蛋白c-Myc和c-Jun的表达均下调。FBXW7基因表 达上调能够抑制肾癌的增殖或者诱导肾癌细胞凋亡，FBXW7基因能够用于治疗肾癌的潜在 靶点。
[0015] 根据本发明的实施例，利用FBXW7质粒转染所述肾癌细胞，使肾癌细胞中的FBXW7 基因过表达，以实现肾癌细胞中的FBXW7基因的表达上调。
[0016] 依据本发明的第五方面，本发明提供一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞 凋亡的方法，所述方法用于非治疗目的，该方