一种质粒dna规模化纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因纯化技术领域，具体涉及一种质粒DNA规模化纯化方法。
【背景技术】
[0002]DNA疫苗，又称核酸疫苗或基因疫苗，是指把携带编码外源抗原基因的DNA(通常是质粒)直接导入体内，通过抗原基因表达产物刺激机体产生特异性免疫反应以达到预防和治疗的目的。近年来，DNA免疫被誉为疫苗技术领域一场新的革命，并在许多动物模型中被证明能够提供免疫保护力抵抗人类免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌、禽流感等传染性病原体的攻击。但质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，因而其用药剂量大，这使质粒DNA作为生物制剂产品的生产面临着新的挑战。目前需要建立的大规模生产过程，可生产毫克级到千克级产量的质粒DNA，除了数量上的要求，对质粒DNA制品的纯度要求也很高，因而分离、纯化是生产过程质粒DNA的重大挑战。
[0003]在实验室的条件下，质粒DNA产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重。质粒的工业化大规模生产除了要除去杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂。
[0004]目前广泛使用规模化纯化质粒DNA色谱法产率低，成本高，效率低下。主要原因是目前市场上的商品化的填料主要是针对蛋白，但是质粒DNA结构与蛋白差异较大，所以导致质粒不能进入大多数的填料孔径内，这就会导致填料对质粒的吸附性能下降，这是色谱法生产质粒的主要缺点。其次色谱法纯化质粒DNA需多步骤，首先离子交换层析，疏水层析，最后凝胶层析。设备投入大，处理量有限，损失大。
[0005]当前质粒DNA的纯化工艺有产量低、成本高的缺点，因此设计和开发新型质粒生产方法有重要的意义。中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术(Tangential FlowFiltrat1n, TFF)的范畴，又称错流过滤(Cross-Flow Filtrat1n，CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有低的剪切力，温和的操作可以有效防止质粒DNA的断裂和杂质蛋白的聚集，有利于保护质粒DNA的超螺旋结构，同时有助于杂蛋白的透过和去除。目前，对于质粒DNA的中空纤维纯化及浓缩工艺尚无报道。
【发明内容】
[0006]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种质粒DNA规模化纯化方法，以解决现有技术的质粒DNA纯化方法不易实现规模化生产的技术问题。
[0007]本发明解决的另一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法工艺过于复杂。
[0008]本发明解决的再一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法成本较高。
[0009]本发明解决的又一技术问题是现有技术的质粒DNA纯化方法收率较低。
[0010]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0011]一种质粒DNA疫苗纯化方法，该方法通过澄清纯化系统和浓缩系统来实现，在实施该方法之前所述澄清纯化系统和浓缩系统应当满足以下条件:
[0012]I系统的组装
[0013]无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.22 μπι、0.45 μ??或0.65 μπκ完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中可安装安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。
[0014]2系统完整性检测
[0015]压力保持法检测系统的完整性。
[0016]3系统的处理
[0017]3.1清洗及灭菌
[0018]将0.5Μ NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环栗300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0019]3.2水洗及通量检测
[0020]灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环栗，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0021]3.3 PBS 处理
[0022]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.0lM PBS溶液注满进料罐，开启循环栗300rpm循环冲洗20min。
[0023]上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%?80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。
[0024]—种质粒DNA规模化纯化方法，包括以下步骤:
[0025]I)将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为0.2?2mol/L，过夜沉淀后，用50?500目纱网过滤裂解液，然后再用10?100 μ m囊式滤器过滤裂解液；
[0026]2)将步骤I)过滤后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗循环，而后经0.22?0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；
[0027]3)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第一洗滤液待用；
[0028]4)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第二洗滤液待用；
[0029]5)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第三洗滤液待用；
[0030]6)将步骤2)所述透过液、步骤3)所述第一洗滤液、步骤4)所述第二洗滤液、步骤5)所述第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0031]7)将步骤6)得到的混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环栗循环，而后经100?500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA裂解液；
[0032]8)以1:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA裂解液；
[0033]9)以1:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA裂解液；
[0034]10)以1:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA裂解液浓缩液；
[0035]11)在步骤10)得到的DNA裂解液浓缩液中加入终浓度0.5?2 % (W/V)的TritonX-114，涡旋振荡后置于冰浴中10?40min ；
[0036]12)将步骤11)处理后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗循环，而后经0.1?0.45 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；
[0037]13)将步骤12)得到的透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入4倍体积的0.0lMPBS，开启循环栗循环，经100?500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA纯化液；
[0038]14)以2:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA纯化液；
[0039]15)以2:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA纯化液；
[0040]16)以2:1 (v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA纯化液；
[0041]17)将步骤16)得到质粒DNA纯化液，用0.22 μ m囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。
[0042]优选的，步骤I)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L。
[0043]优选的，步骤I)所述的纱网孔径为200