目，囊式滤器的孔径为30 μ m。
[0044]优选的，步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45 μ m0
[0045]优选的，步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。
[0046]优选的，步骤11)所述的加入的Triton X-114，使终浓度为1.5% (W/V)。
[0047]优选的，步骤11)所述的冰浴时间为30min。
[0048]优选的，步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22 μ m。
[0049]优选的，步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD。
[0050]优选的，以上步骤2)、3)、4)、5)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)或 16)中所述开启循环栗循环的操作条件均为400rpm循环30min。
[0051]将上述制备的质粒DNA成品保存于4°C。
[0052]在本发明中，所述澄清纯化系统专指生物技术领域中的中空纤维澄清纯化系统，进一步可以专指由通用电气公司(General Electric Company, GE)出品的型号为FlexStand的中空纤维澄清纯化系统。所述浓缩系统是指生物技术中内装有中空纤维超滤柱、能够执行超滤浓缩的的各种装置。
[0053]上述质粒DNA纯化方法，采用的是三步纯化法，第一步通过加入氯化钙使细菌基因组DNA和RNA以及大部分杂蛋白凝集后，通过纱网和囊式滤器过滤去除大块杂质，然后通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤质粒DNA裂解液，除去裂解液中小的碎片以及基因组DNA ;第二步通过较小孔径的浓缩纯化滤膜浓缩洗滤质粒DNA，达到除去质粒DNA裂解液中的小分子化学物质、杂蛋白，RNA等杂质以及实现浓缩质粒DNA等目的；第三步通过加入表面活性剂Triton X-114，去除内毒素，并再次洗滤去除杂蛋白及RNA的杂质。
[0054]上述质粒DNA纯化方法中，步骤I)所述的加入的氯化钙，使终浓度为2mol/L MI)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30μπι;步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.22 μπι;步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD ;步骤11)所述的加入的Triton X-114，使终浓度为1.5% (W/V);步骤11)所述的冰浴时间为30min ;步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22 μ m ;步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD ;步骤2、3、4、5、7、8、9、10、12、13、14、15、16中所述的开启循环栗循环一定时间的操作条件均为400rpm循环30min ;上述所述质粒DNA澄清纯化及浓缩方法，步骤2)中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90%;步骤7)中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩50倍以上。
[0055]本发明的优点:
[0056]1、本发明的纯化方法综合采用三级纯化，重复洗滤，表面活性剂去除内毒素等一系列工艺，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了纯化成本，提高了质粒DNA的纯度。
[0057]2、本发明纯化质粒DNA的工艺及设备易线性放大，适用于规模化生产质粒DNA疫苗。
[0058]3、本发明纯化质粒DNA的工艺安全，尽量避免使用了有毒，易燃易爆有机试剂和动物源性的酶试剂。
[0059]4、本发明所纯化的质粒DNA各项检测指标均能达到或接近中国食品和药品监督管理局(CFDA)的质量标准。
[0060]本发明采用美国通用电气公司(General Electric Company，GE)的中空纤维超滤膜澄清纯化系统对质粒DNA进行纯化和浓缩，并设计了一整套工艺，极大的提高了质粒DNA的生产效率，降低了纯化成本。
【附图说明】
[0061]图1是本发明【具体实施方式】中纯化后的质粒DNA成品核酸电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0062]以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0063]以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0064]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0065]以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0066]实施例1
[0067]I仪器及试剂
[0068]1.1实施例所用仪器如下:
[0069]中空纤维澄清纯化系统，型号=FlexStand ;微滤柱，0.22 μπι ;超滤柱，300KD，购自GE公司。30 μ m、0.22 μ m囊式滤器购自多明尼克公司。
[0070]1.2实施例所用试剂如下:
[0071](I) 100L质粒DNA裂解液，由本公司生产；
[0072](2)0.5M NaOH 100L ；0.0lM PBS200L ;高纯水 100L ；
[0073]2本实施例包括以下步骤
[0074]2.1前处理
[0075]2.1.1系统的组装
[0076]无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.22 μπκ完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜；
[0077]2.1.2系统完整性检测
[0078]压力保持法检测系统的完整性。
[0079]2.1.3系统的处理
[0080]清洗及灭菌:
[0081]将0.5Μ NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环栗300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0082]水洗及通量检测:
[0083]灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环栗，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0084]PBS 处理:
[0085]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.0lM PBS溶液注满进料罐，开启循环栗300rpm循环冲洗20min。
[0086]2.2质粒DNA的澄清纯化
[0087]2.2.1质粒DNA裂解液的处理
[0088]将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为2mol/L。过夜沉淀后，用200目纱网过滤裂解液，然后再用30 μ m囊式滤器过滤裂解液。
[0089]2.2.2质粒DNA裂解液的澄清
[0090]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗，400rpm循环30min，经0.22 μπι中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0091]2.2.3截留液的洗滤
[0092]第一次洗滤:
[0093]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0094]第二次洗滤:
[0095]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0096]第三次洗滤:
[0097]将1L无菌的0.01M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗400rpm循环30min，收集透过液10L。
[0098]2.2.4质粒DNA裂解液的收集
[0099]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0100]2.3