余截留液2L，记为初级质粒DNA浓缩液。
[0170]2.1浓缩液的洗滤
[0171]第一次洗滤:
[0172]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去透过液4，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA浓缩液。
[0173]第二次洗滤:
[0174]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA浓缩液。
[0175]第三次洗滤:
[0176]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA裂解液最终浓缩液。
[0177]实施例4
[0178]将质粒DNA裂解液浓缩液中加入Triton X-114 30g使终浓度为1.5 % (W/V)，涡旋振荡后置于冰浴中30min，期间多次混匀样品。
[0179]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的质粒DNA裂解液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗，400rpm循环30min，经0.22 μπι中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液。
[0180]浓缩系统处理完毕后，将透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入0.0lM PBS8L，开启循环栗，400rpm循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液2L，记为初级质粒DNA纯化液。
[0181]第一次洗滤:
[0182]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去透过液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为二级质粒DNA纯化液。
[0183]第二次洗滤:
[0184]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，记为三级质粒DNA纯化液。
[0185]第三次洗滤:
[0186]将4L 0.0lM PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环栗，400rpm循环30min，弃去洗滤液4L，进料罐中剩余截留液2L，即为质粒DNA纯化液。
[0187]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为0.2?2mol/L，过夜沉淀后，用50?500目纱网过滤裂解液，然后再用10?100 μ m囊式滤器过滤裂解液； 2)将步骤I)过滤后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗循环，而后经0.22?0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用； 3)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第一洗滤液待用； 4)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第二洗滤液待用； 5)以l:2(v/v)的比例将无菌的0.0lM PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环栗循环，收集透过液，得到第三洗滤液待用； 6)将步骤2)所述透过液、步骤3)所述第一洗滤液、步骤4)所述第二洗滤液、步骤5)所述第三洗滤液混合均匀，得到混合液； 7)将步骤6)得到的混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环栗循环，而后经100?500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA裂解液； 8)以l:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA裂解液； 9)以l:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA裂解液； 10)以l:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA裂解液浓缩液； 11)在步骤10)得到的DNA裂解液浓缩液中加入终浓度0.5?2% (W/V)的TritonX-114，涡旋振荡后置于冰浴中10?40min ； 12)将步骤11)处理后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环栗循环，而后经0.1?0.45 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用； 13)将步骤12)得到的透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入4倍体积的0.0lM PBS,开启循环栗循环，经100?500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA纯化液； 14)以2:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA纯化液； 15)以2:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA纯化液； 16)以2:l(v/v)的比例将0.0lM PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环栗循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA纯化液； 17)将步骤16)得到质粒DNA纯化液，用0.22 μ m囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。2.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤I)所述的加入的氯化1丐，使终浓度为2mol/L。3.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤I)所述的纱网孔径为200目，囊式滤器的孔径为30 μ m04.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45 μ m。5.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。6.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的加入的 Triton X-114，使终浓度为 1.5% (W/V)。7.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤11)所述的冰浴时间为30min。8.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤12)所述的微滤的滤膜孔径为0.22 μ m09.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤13)所述的超滤滤膜孔径为300KD。10.根据权利要求1所述的质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于步骤2)、3)、4)、5)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)或16)中所述开启循环栗循环的操作条件均为400rpm循环 30min。
【专利摘要】本发明提供了一种质粒DNA规模化纯化方法，该方法采用三步纯化，第一步通过加入氯化钙使细菌基因组DNA和RNA以及大部分杂蛋白凝集后，通过纱网和囊式滤器过滤去除大块杂质，然后通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤质粒DNA裂解液，除去裂解液中小的碎片以及基因组DNA；第二步通过较小孔径的浓缩纯化滤膜浓缩洗滤质粒DNA，达到除去质粒DNA裂解液中的小分子化学物质、杂蛋白，RNA等杂质以及实现浓缩质粒DNA等目的；第三步通过加入表面活性剂Triton？X-114，去除内毒素，并再次洗滤去除杂蛋白及RNA的杂质。以上方法依托于中空纤维超滤膜澄清纯化系统对质粒DNA进行纯化和浓缩，工艺合理有效，极大的提高了质粒DNA的生产效率，降低了纯化成本。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105200038
【申请号】CN201510673296
【发明人】唐荣宏, 李亚杰, 杨保收, 付旭彬, 梁武
【申请人】天津瑞普生物技术股份有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月16日