一种同时高效提取rna和dna的方法及试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同时高效提取RNA和DNA的方法及试剂。
【背景技术】
[0002] 在生物及生物技术的研究和应用中，RNA的提取已经成为重要的基本实验技术。尽 管已经建立了多种提取方法，但对于特定的材料和不同的实验室，需要从材料、可利用的试 剂及基金等方面考虑从而做出不同的选择。此外，提取的RNA的质量直接影响后续的研究 结果。
[0003] 通常采用异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚等强变性剂来提取细胞或组织的总RNA。异 硫氰酸胍和盐酸胍都是强烈的蛋白变性剂，不仅能有效解离核蛋白和核酸的复合体，还能 强烈抑制RNA酶的活性，并且与加入的P-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用。这 种方法的优点在于用了强烈的蛋白变性剂，对细胞本身和提取液中的RNase的活性有非常 好的抑制效果。
[0004] 为了提高RNA提取的效率，GIBC0BRL公司提出了 "硫氰酸胍-酚-氯仿"抽提法， 即TRIZOL法。TRIzoI主要成份是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保 护RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集 上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋 白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉 淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是 细菌组织，TRIzoI法对少量的组织（50-100mg)和细胞（5 XIO6)以及大量的组织（彡Ig) 和细胞（>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样 品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。 故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A) +选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克 隆。TRIZOL试剂能使不同种属不同分子量大小的多种RNA析出。因此，TRIZOL法的特点是 快速，高效，获得RNA浓度高、纯度高，不需要超速离心或多步酚-氯仿抽提。
[0005] 以上两种方法虽然均能较好的提取大部分组织和细胞中的总RNA，但是，由于准备 试剂种类多，操作步骤多，耗时长，一般提取一次需花费2小时左右，并且由于操作手法问 题，会造成不同批次RNA提取的质量或浓度相差过大，且RNA质量很容易受环境中RNAse的 破坏。
[0006] 为了简化RNA提取方法，提高提取效率，目前市面上也有一些组装开发的试剂 盒。Invitrogen公司的RNAMiniKit，利用快速脱盐法去除污染的大分子物质，能从大量 样本中纯化出总RNA;Promega公司的TotalRNAIsolationSystem，采用离心或抽滤技 术，用高浓度的亚硫氰胍稀释细胞，使RNA酶失活，并选择性的沉淀胞内蛋白，可从组织， 细胞，细菌和血液中直接提取RNA，具有高效，快速的特点；Qiagen公司的RNAIsolation MiniKit含RNA稳定剂，使RNA保持原有的表达模式，应用硅胶膜技术和柱式离心技术，用 RNase-FreeDNaseset，在分离RNA的过程中直接在纯化离心柱上消化DNA，最后洗脱得到 纯净的RNA，该试剂盒步骤简单，无需酚-氯仿抽提，也不用进行繁琐的RNA沉淀，且RNA产 物中不含5SrRNA，tRNA或其他低分子量RNA;Ambion公司的RNAwizTMKit利用一步法提 取，可在Ih内完成，并可大量提取RNA;上海生工的TRIZOL总RNA抽提试剂盒（UNIQ-10柱 式），利用柱式离心技术，可从组织，细菌和细胞中提取200个碱基以上的总RNA;北京天根 的RNApreppureCellKit利用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，从培 养细胞或细菌中分离纯化高质量的总RNA。使用试剂盒提取细菌总RNA主要有以下优点： 速度快，一般不超过Ih;提取试剂中一般含有抑制RNA酶活性的成分，能较好的防止RNA降 解，得到的RNA纯度和浓度较高。试剂盒提取虽然效率高，获得的RNA质量高，并且能同时 处理大量样本，但是价格较高，一般通用型的50次总RNA提取试剂盒价格为1000元左右， 如果是国外品牌价格会在这个基础上高出2-3倍。尤其在需要大量长期提取样本RNA时， 花费过大，不能普遍适用于广大的实验室。
[0007] 针对以上缺点，研发一种快速、高效、廉价的RNA提取方法及试剂具有重要的现实 意义。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种同时高效提取RNA和DNA的方法及试剂。该提取试 剂种类少，操作简单快速，成本低，提取效果稳定，RNA质量合格，可用于大批样本的RNA的 提取和长时间使用，且能够同时完成同一样本RNA和DNA的提取，节省了提取时间。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种RNA提取试剂，包括如下组分：
[0011] BufferA:盐酸胍，吗啉乙磺酸，EDTA，DEPC水；
[0012] BufferB:醋酸钠，DEPC水；
[0013] BufferC:乙醇，DEPC水。
[0014] 本发明改善了RNA提取试剂的种类及其配比，本发明提供的RNA提取试剂种类少， 操作简单快速，成本低，提取效果稳定高效，RNA质量合格，可用于大批样本的RNA的提取和 长时间使用。
[0015] 作为优选，RNA提取试剂包括如下组分：
[0016] BufferA: 1 ~10mol/L盐酸狐，10 ~50mmol/L吗琳乙横酸，10 ~50mmol/LEDTA， 余量为DEPC水；
[0017] BufferB:1~IOmo1/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0018] BufferC:50% ~90 % 乙醇，余量为DEPC水。
[0019] 优选地，RNA提取试剂包括如下组分：
[0020] BufferA:3 ~5mol/L盐酸狐，10 ~30mmol/L吗啉乙横酸，10 ~30mmol/LEDTA, 余量为DEPC水；
[0021] BufferB:2 ~4mol/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0022] BufferC:60%~80% 乙醇，余量为DEPC水。
[0023] 更优选地，RNA提取试剂包括如下组分：
[0024] BufferA:4mol/L盐酸胍，20mmol/L吗啉乙磺酸，20mmol/LEDTA，余量为DEPC水；
[0025] BufferB:3moI/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0026]BufferC:7〇 % 乙醇，余量为DEPC水。
[0027] 作为优选，Buffer B的pH值为5. 0~6. 0。
[0028]优选地，BufferB的pH值为 5. 2。
[0029] 本发明还提供了一种提取RNA的方法，包括如下步骤：
[0030] 步骤1 :采用BufferA裂解细胞，得到细胞裂解混合物；
[0031] 步骤2 :将细胞裂解混合物与乙醇水溶液混合，加入硅胶膜离心柱中，离心，弃掉 液体，加入BufferB进行洗涤，再次离心；
[0032] 步骤3 :向硅胶膜离心柱中加入BufferC进行洗涤，离心，弃掉液体，再次离心，洗 脱得到RNA;
[0033] Buffer A包括：盐酸胍，吗啉乙磺酸，EDTA，DEPC水；
[0034] BufferB包括：醋酸钠，DEPC水；
[0035]BufferC包括：乙醇，DEPC水。
[0036] 作为优选，RNA提取试剂包括如下组分：
[0037]BufferA:1~10mol/L盐酸狐，10~50mmol/L吗琳乙横酸，10~50mmol/LEDTA， 余量为DEPC水；
[0038] BufferB: 1~IOmo1/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0039] BufferC:50% ~90 % 乙醇，余量为DEPC水。
[0040] 优选地，RNA提取试剂包括如下组分：
[0041 ]BufferA:3 ~5mol/L盐酸狐，10 ~30mmol/L吗啉乙横酸，10 ~30mmol/LEDTA, 余量为DEPC水；
[0042]BufferB:2 ~4mol/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0043] BufferC:60% ~80 % 乙醇，余量为DEPC水。
[0044] 更优选地，RNA提取试剂包括如下组分：
[0045]BufferA:4mol/L盐酸狐，20mmol/L吗啉乙横酸，20mmol/LEDTA，余量为DEPC水；
[0046]BufferB:3moI/L醋酸钠，余量为DEPC水；
[0047] BufferC:70% 乙醇，余量为DEPC水。
[0048] 作为优选，Buffer B的pH值为5. 0~6. 0。
[0049] 优选地，Buffer B 的 pH 值为 5. 2。
[0050]作为优选，BufferA、BufferB与BufferC的体积比为（250 ~450) : (400 ~600): (300 ~500) 〇
[0051] 在本发明提供的一些实施例中，Buffer A、Buffer B与Buffer C的体积比为 350:500:400〇
[0052] 作为优选，细胞裂解混合物与乙醇水溶液的体积比为（1~2) : (1~2)，乙醇水溶 液的体积百分含量为90 %~99 %。
[0053] 优选地，细胞裂解混合物与乙醇水溶液的体积比为1:1，乙醇水溶液的体积百分含 量为96%。
[0054] 作为优选，离心的转速为8000~15000g。
[0055] 优选地，离心的转速为8000~12000g。
[0056] 在本发明提供的一些实施例中，除步骤3中再次离心的转速为12000g，其余的离 心步骤的转速为8000g。
[0057] 在本发明提供的一些实施例中，硅胶膜离心柱为普通硅胶膜柱式离心柱。
[0058] 本发明还提供了一种RNA和DNA提取试剂，包括如下组分：
[0059] BufferA:盐酸胍，吗啉乙磺酸，EDTA，DEPC水；
[0060] BufferB:醋酸钠，DEPC水；
[0061] BufferC:乙醇，DEPC水；
[0062] BufferD:NaOH溶液。
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